蠟狀芽孢桿菌CZ磷酸甘露糖異構酶基因的克隆表達及酶學性質研究

張 瑤,崔堂兵,宋 妍

(華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006)

蠟狀芽孢桿菌CZ磷酸甘露糖異構酶基因的克隆表達及酶學性質研究

張 瑤,崔堂兵*,宋 妍

(華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006)

將蠟狀芽孢桿菌CZ中的磷酸甘露糖異構酶基因(pmi)進行克隆,并在大腸桿菌中進行異源表達。將PCR擴增得到的pmi基因與pET-22b(+)表達載體進行連接,轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,構建重組菌株BL21-pET22b(+)-pmi,并成功表達了重組磷酸甘露糖異構酶。結果顯示:克隆得到pmi基因序列全長為948 bp,編碼315個氨基酸。通過鎳柱HisTrap HP親和層析法純化得到具有活性的重組酶,其蛋白分子大小約為40.8 ku。酶學性質結果顯示:該酶的最適反應溫度為35 ℃,在30～40 ℃酶活力相對穩定;最適pH為7.0,在弱堿性條件下保存12 h后仍存有50%以上酶活力;不同低濃度的金屬離子Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+和Mg2+均對該酶表現出不同程度的激活作用,其中Mn2+對該酶激活作用最顯著,當其濃度為1 mmol/L時,激活作用最大,而Co2+對其有明顯的抑制作用。

磷酸甘露糖異構酶(PMI),蠟狀芽孢桿菌,克隆表達,酶學性質

磷酸甘露糖異構酶(phosphomannose isomerase,簡稱:PMI,EC 5.3.1.8)是一種在生物體內可逆催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸之間相互轉化的金屬酶[1-2],在甘露糖代謝途徑中及GDP-甘露糖的生物合成中均起著重要的作用[3-4]。近年來,有報道[5]稱磷酸異構酶不僅可以催化磷酸糖之間的異構反應,也可以作用于單糖異構化,表明磷酸糖可以代替自然界中不存在的異構酶進行糖異構化作用,這些酶可以作為生物催化劑[6]來促進和簡化許多化學過程來生產自然界中含量極少的稀有單糖。

L-核糖[7]是極為昂貴的稀有糖類,是合成具有抗病毒活性的核苷類化合物的潛在起始原料,在自然界并不存在。L-核糖[8]對抗腫瘤和病毒有良好的效果,并且對正常細胞的毒副作用極小,顯示了強大的抗艾滋病、抗病毒中間體方面的潛能。L-核糖中間體與腺嘌呤等有機堿形成的核苷衍生物在癌癥、乙肝、丙肝等疾病的治療方面也具有重要的醫學價值。近年來,多種來源磷酸異構酶[9-11]已成功應用于生物轉化法制備L-核糖,但轉化效率并不高,而生物轉化關鍵性的一步就是磷酸甘露糖異構酶的催化異構作用[12]。目前,磷酸甘露糖異構酶已成功地從細菌和真菌等中克隆并在相應的表達系統中進行了表達,如大腸桿菌(E.coli)[13]、人類(H.sapiens)[14]、白色念球菌(C.albican)[15]、嗜熱脫氮地芽孢桿菌(G.thermodenitrificans)[16]等。已有報道來源嗜熱棲細菌(T.thermophilus)[17]、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[18]的磷酸甘露糖異構酶協同L-阿拉伯糖異構酶等利用L-阿拉伯糖通過生物轉化法得到L-核糖,而國內幾乎還沒有來源于蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)的磷酸甘露糖異構酶的克隆表達及有關酶學性質報道。

本文研究內容是對實驗室保存的蠟狀芽孢桿菌CZ中磷酸甘露糖異構酶基因進行克隆,并在E.coliBL21(DE3)中異源表達。通過在重組質粒中引入6×His-Tag標簽,用鎳柱HisTrap HP親和層析純化重組酶,并進一步研究其酶學性質,為其工業應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟狀芽孢桿菌CZ菌株、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌DH5α、質粒pET22b(+) 本實驗室保存;限制性內切酶BamHI和SalI、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體及蛋白質標準分子量、DNA標準分子量、Prime START HS DNA聚合酶、細菌全基因組提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA 純化試劑盒 TaKaRa公司;蛋白質標準分子 賽默飛公司,質粒小量提取試劑盒 OMEGA公司;其他試劑 均為國產分析純;LB培養基、LBA培養基、藍白斑平板配制等 均按照TaKaRa商品目錄配制。

PCR儀 德國Biometra東勝創新生物技術科技有限公司;Eppendorf冷凍離心機 Eppendorf公司;脫色搖床ZD-9556 常州華利達集團有限公司;超聲波細胞粉碎機JY92-IIN 美國SONICS;紫外可見分光光度計UV-2802SH 上海尤尼柯儀器有限公司;SpectraMax M5 酶標儀 美國Molecular Devices;DYY-8C 型電泳儀 北京市六一儀器廠DH1008;HisTrap HP、AKTApurifer 通用電氣(GE)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1pmi基因的克隆 以提取的蠟狀芽孢桿菌CZ菌株的全基因組為模板,根據已發表的蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisHD1002,Genebank 登陸號:CP009349)的磷酸甘露糖異構酶的全長基因序列設計引物,利用PCR法擴增CZ中pmi基因序列,引物兩端分別引入BamHI和SalI酶切位點。上游引物22bs:5′-CGCGGATCCGACTGAACCATTATTTTTT GCA-3′,下游引物22ba:5′-CGCGTCGACATATTTA CTTGAAACAATACAT-3′。PCR擴增條件:98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 1 min,30個循環,72 ℃延伸10 min。PCR產物泡電泳切膠回收目的片段。

1.2.2 大腸桿菌表達載體的構建 將目的片段用BamHI和SalI雙酶切后切膠回收,再與雙酶切后切膠回收的pET22b(+)載體片段在16 ℃下連接過夜,連接產物轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞,涂布含氨芐青霉素抗性平板,37 ℃下培養過夜。挑取陽性轉化子提質粒并送廣州艾基生物公司測序,含正確克隆序列的質粒命名為pET22b(+)-pmi。

1.2.3 目的質粒在大腸桿菌中的誘導表達 將含有重組表達質粒pET22b(+)-pmi的E.coliBL21(DE3)單菌落接種于10 mL的LB液體管(含50 μg/mL的氨芐青霉素)中,37 ℃ 200 r/min培養過夜,然后以1% 接種量接入50 mL的LB液體培養基(含50 μg/mL的氨芐青霉素)中,37 ℃ 200 r/min培養至OD600為0.6時,加入IPTG誘導劑至終濃度0.1 mmol/L,在30 ℃下誘導6 h。12000 r/min下離心10 min收集菌體,保存于-80 ℃。

1.2.4 重組酶的純化及SDS-PAGE分析 粗酶液的制備:將離心收集的菌體用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)洗滌3次,然后按照50～100 mg/mL菌體濃度配成重懸液,冰上超聲破碎(5 s,間隔時間5 s,重復100次,功率400 W),然后4 ℃ 12000 r/min下離心20 min去除細胞碎片,收集的上清液即為粗酶液。

重組酶純化方法:將粗酶液經過0.22 μm濾膜過濾后使用GE公司的鎳柱HisTrap HP進行純化。純化按照操作手冊進行,首先使用結合緩沖液Buffer A(50 mmol/L PBS緩沖液、20 mmoL咪唑、0.5 mol/L NaCl、pH7.4)平衡預裝柱,然后開始上樣,當紫外吸收開始上升,同時離子濃度開始下降時,收集一管樣品穿過液,再用Buffer A洗去非特異性結合,接著用洗脫緩沖液Buffer B(50 mmol/L PBS緩沖液、500 mmol/L咪唑、0.5 mol/L NaCl、pH7.4)進行梯度洗脫結合蛋白,每個梯度下觀察到出峰都進行收集,最后采用Bradford法[19]進行蛋白含量的測定,以牛血清蛋白BSA溶液作標準曲線。

目的蛋白分子量的確定用標準SDS-PAGE蛋白電泳法[20],制備12%的分離膠和5%的濃縮膠,在80 V和120 V的電壓下進行不連續垂直平板電泳,凝膠用考馬斯亮藍染色。

1.2.5 重組酶活力測定 Dische等[21]早期提出的測定酮糖類物質的方法,即半胱氨酸鹽酸鹽-咔唑法,簡稱BK法,以此法為基本依據稍微改進[22]用來測定重組酶pmi活力。BK法的原理是:依據酮糖物質在硫酸溶液中與顯色劑咔唑反應,顏色會隨著酮糖含量不同而有差別。1 mL的酶反應液[18]中分別加入10 mmol/L的L-核糖,1.5 U/mL重組酶,50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0),在35 ℃下反應20 min,再加入終濃度為200 mmol/L的HCl來終止反應,最后測定酶活力。

1.2.6 重組酶酶學性質分析

1.2.6.1 最適反應溫度和溫度穩定性 將酶反應液分別在20、25、30、35、40、45、50、60 ℃條件下測定重組磷酸甘露糖異構酶活力以確定最適反應溫度。將酶液在反應之前分別在30、35、40 ℃水浴中保溫孵育0.5、1.0、1.5、2.0 h,于最適溫度下測定經過不同溫度孵育不同時間酶液的活力以確定酶液在不同溫度下的穩定性。

1.2.6.2 最適反應pH及pH的穩定性 在最適反應溫度條件下,將用于測定的底物pH分別調至5.0、6.0、7.0、7.6、8.0、9.0,測定不同pH條件下的重組磷酸甘露糖異構酶活力。然后將酶液反應前分別在pH為6.0、7.0、8.0條件下孵育3、6、9、12 h以探究不同pH下的酶的穩定性。

1.2.6.3 不同金屬離子及金屬離子的不同濃度對酶活力的影響 用最適pH的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液配制酶液,分別向酶液中加入終濃度為1 mmol/L的Ni2+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+(以不加金屬離子為對照),在最適溫度下測定酶活力,探究不同金屬離子對酶活力的影響。在反應體系加入濃度分別為0.5、1、2、3、4、5 mmol/L的金屬離子,探究最適金屬離子濃度。

2 結果與分析

2.1pmi基因的擴增及重組質粒構建

以提取的蠟狀芽孢桿菌CZ全基因組作為模板,利用設計的引物22bs和22ba擴增得到pmi目的基因全長,PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到與預期大小相符的基因片段,大小約為1000 bp(圖1),該片段與已知的B.thuringiensis(GenBank:CP009349.1)的pmi全長同源性較高達98%。鑒定結果說明成功擴增并克隆了pmi基因片段。

圖1 PCR產物pmi電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of pmigene PCR amplifiction注:M:DNA Marker;1:PCR擴增產物。

為了實現pmi基因在E.coliBL21(DE3)中的成功表達,將擴增出的pmi基因片段連接到表達載體pET-22b(+)上,構建重組表達載體pET-22b(+)-pmi。將菌液PCR驗證初步正確的陽性轉化子提取質粒,用BamHI和SalI兩種限制性內切酶雙酶切驗證重組表達質粒pET-22b(+)-pmi,經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)結果顯示,陽性轉化子菌液PCR驗證結果與目的基因大小(948 bp)基本相符,用BamHI和SalI兩種限制性內切酶從表達載體pET-22b(+)-pmi切下的條帶與擴增出的pmi基因片段及表達載體pET-22b(+)線性大小相符,說明pmi基因已成功插入到載體pET-22b(+)中,重組表達載體構建成功。

圖2 菌液驗證及重組質粒雙酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis results of the PCR of bacteria and the recombinant plasmid with double digestion 注:M:DNA Marker;1:陽性轉化子菌液PCR驗證;2:質粒pET-22b(+)經BamHI和SalI雙酶切;3:重組質粒PET-22b(+)-pmi經BamHI和SalI雙酶切。

2.2 序列分析

將初步驗證正確陽性菌送測序,結果顯示克隆片段大小為948 bp,編碼315個氨基酸。經Clustal Omeg在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行蛋白序列比對,其與來源蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensisHD 1002)的序列同源性為97%,與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、艾丁湖鹽漬芽孢桿菌(S.aidingensis)的同源性都高達到70%以上,它們都屬于cupin-like超級家族,序列比對結果如圖3所示。

2.3 重組酶的異源表達及分離純化

將重組質粒pET22b(+)-pmi轉入E.coliBL21(DE3)感受態細胞中,進行目的基因誘導表達,將表達后的細胞破碎液上清進行SDS-PAGE分析。根據Protparam在線蛋白分析軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白分子量為36.1 ku,加上表達載體上6×His-Tag標簽等序列,最后推測出表達出來的目的蛋白大小約為40.8 ku左右。如(圖4)所示,以空載質粒為對照,在40.8 ku處出現特征條帶,且與目標蛋白的理論值吻合,說明目的基因在大腸桿菌宿主中成功實現了重組異源表達。

將粗酶液經鎳柱HisTrap HP親和層析后,收集樣品穿過液和洗脫峰并進行SDS-PAGE(圖5),得到一條特異性條帶,結果與預測蛋白分子量相符。這與來源大腸桿菌[13]、S.typhimurium[23]、T.thermophilus[17]的PMI蛋白分子量大小(依次分別為36、42.6、29.0 ku)有所差異,可能是由于來源不同導致同一種蛋白在其生物體內具有不同的結構特性,進而分子量有所不同。

經鎳柱HisTrap HP親和層析純化后,重組酶比酶活為6.18 U/mg,是純化前的4.26倍,回收率為37%,結果見表1。

此外,根據1.2.4所述方法,測得蛋白質濃度標準曲線如圖6所示,其標準曲線方程為Y=5.3271X+0.0055,相關系數R2=0.9955,說明在此范圍內蛋白質濃度與吸光值的線性關系良好。

2.4 重組酶的酶學性質研究

2.4.1 溫度對重組磷酸甘露糖異構酶的影響及重組酶的熱穩定性 將純化后的重組磷酸甘露糖異構酶在不同溫度下測定酶活,結果圖7(A)顯示,該酶的最適作用溫度為35 ℃,在30～40 ℃范圍內測定酶活,相對酶活在60%以上。另外,如圖7(B)所示,該酶在30、35、40 ℃保溫2 h,殘余酶活可保持在40%上。Yeom[16]等學者通過嗜熱脫氮地芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)來源克隆得到的PMI最適反應溫度為60～70 ℃。由陸春麗[22]用常溫微生物發酵得到的PMI在35～45 ℃范圍時PMI酶活力整體相對較高,當溫度超過50 ℃時,酶活力已經降了一半,繼續升高溫度后酶活力急劇減小,PMI在30 ℃時穩定性最好,與本實驗結果基本一致。此外,Soo[18]研究來源B.subtilis的PMI也顯示其40 ℃時酶活力反應最高。有些非嗜熱性芽孢桿菌如本文研究的B.cereus生存環境就是常溫,過高的溫度會破壞其體內酶構象,導致酶活力降低。

表1 重組磷酸甘露糖異構酶的純化

圖4 重組磷酸甘露糖異構酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant phosphomannose isomerase注:M:低分子量蛋白標準;1:誘導表達的重組酶;2:空質粒pET-22b(+);3:未誘導的重組酶。

圖5 重組磷酸甘露糖異構酶純化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant phosphomannose isomerase注:M:PageRulerTM Unstained Broad Range Protein Ladder;1、2:純化的重組酶;3:流穿液;4純化前的重組酶。

圖6 蛋白質濃度標準曲線Fig.6 Standard curve of protein concentration

圖7 溫度對重組酶活力的影響及其溫度穩定性Fig.7 Effect of different temperature on activity of recombinant enzyme and its thermostability注:A:溫度對重組酶活力的影響;B:重組酶的溫度穩定性。

2.4.2 pH對重組磷酸甘露糖異構酶的影響及重組酶的pH穩定性 將純化后的重組磷酸甘露糖異構酶在不同pH下測定酶活,結果如圖8(A)所示,該酶最適作用pH為7.0,并且在pH9.0條件下的相對酶活約為40%。可見,重組酶屬于中性偏弱堿性酶;該重組酶在不同pH條件下的穩定性如圖8(B)所示,在pH6.0～8.0保存12 h,殘余酶活在50%以上,其中在pH為7.0時它的穩定性最好。這與Yeom團隊研究的來源G.thermodenitrificans[16]、T.thermodenitrificans[17]、B.subtilis[18]的PMI的最適pH為7.0一致,推測該酶普遍適應中性條件下反應。

圖8 pH對重組磷酸甘露糖異構酶活力的影響及酶的pH穩定性Fig.8 Effect of different pH on activity of recombinant enzyme and its pH stability注:A:pH對酶活力的影響;B:酶的pH穩定性。

2.4.3 金屬對重組磷酸甘露糖異構酶的影響 金屬離子的添加,對單糖異構化反應的貢獻較大,因為二價金屬離子對醛糖和酮糖異構酶的空間結構起到穩定作用,更重要的是這些金屬離子可以結合的部位基本上是酶的活性中心[24],主要機理是作用于酮糖和醛糖的C2和C3羥基基團,進而發生異構。如圖9(A)所示,低濃度Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+和Mg2+等對PMI酶表現出不同程度的激活作用,Mn2+對重組PMI有較明顯的激活作用,而Co2+對重組PMI有較明顯的抑制作用。圖9(B)顯示,不同濃度Mn2+的對酶活力有不同的激活效果,其中濃度為1 mmol/L時,酶活力最高。這結果與其他不同來源的PMI比較而言都是低濃度的金屬離子對酶活有較大促進作用,當離子濃度過高反而會抑制酶反應；其次,不同的金屬離子對來源不同的PMI酶有不同的作用:如Co2+對本文來源的PMI有極大的抑制作用,卻對來源B.subtilis[18]、G.thermodenitrificans[12]的PMI的影響最大,是最有效的酶活促進劑,提高酶活力分別為2.5、3.0倍左右。0.5 mmol/L的Cu2+對T.thermophilus[17]來源的PMI促進作用最大達2.5倍。產生這些差異的原因可能是由于酶的活性中心不同導致的。

圖9 不同金屬離子對重組酶活力的影響及同一金屬的不同濃度對重組酶活的影響 Fig.9 Effect of different metal on activity of recombinant enzyme and the effect of different concentration with same metal on recombinant enzyme 注:A:不同金屬離子對酶活力的影響;B:不同濃度的Mn2+對酶活力的影響。

3 結論

成功克隆了本實驗室保存的蠟狀芽孢桿菌CZ中的pmi編碼基因序列,全長948 bp,與已知B.thuringiensis的pmi核酸序列同源性高達98%;成功構建表達載體pET22b(+)-pmi,并獲得重組菌株E.coliBL21(DE3)-pET22b(+)-pmi,其在培養至OD600值達到0.6左右加入0.1 mmol/L IPTG在30 ℃誘導6 h成功表達重組PMI蛋白。經鎳柱HisTrap HP親和層析法純化后得到純化目的蛋白,分子量約為40.8 ku。活性特征鑒定表明,重組PMI最適反應溫度為35 ℃,最適反應pH為7.0,屬于中性酶,低濃度Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+和Mg2+對其有不同程度激活作用,Mn2+對該酶激活作用較為明顯,當Mn2+離子濃度為1 mmol/L時,對酶活激活作用達到最大,而Co2+對該酶有較明顯的抑制作用。

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Gene cloning and expression of a phosphomannose isomerase fromBacilluscereusCZ and characterization of the recombinant enzyme

ZHANG Yao,CUI Tang-bing*,SONG Yan

(School of Biological Science and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

TheBacilluscereusCZ phosphomannose isomerase gene(pmi)were cloned and heterogeneously expressed inEscherichiacoli. Thepmigene which was amplified by using PCR was connected with pET-22b(+)expression vector,then the recombinant plasmid was transferred toE.coliBL21(DE3). The recombinant strain BL21-pET22b(+)-pmiwas constructed and successfully expressed recombinant enzyme. The results showed that pmigene(948 bp)was cloned and encoded 315 amino acids. The crude recombinant enzyme was purified by HisTrap HP Ni-affinity chromatography and the molecular mass of the purified recombinant enzyme was detected about 40.8 ku. The enzymatic characteristics analysis showed that the optimal temperature was estimated to be 35 ℃,and it retained relatively stable at 30～40 ℃. Meanwhile,the optimal pH of the recombinant enzyme was around 7.0,and relative enzyme activity was retained 50% in weak alkaline environment for 12 h. Various low concentrations of metal ion,such as Ni2+,Ca2+,Zn2+,Cu2+,Mg2+,could activate the recombinant enzyme in different degree. Mn2+had most obviously of activation with a concentration of 1 mmol/L,whereas Co2+had obviously inhibitory effect on the recombinant enzyme.

phosphomannose isomerase;Bacilluscereus;cloning and expression;enzymatic characteristics

2016-09-26

張瑤(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：生物工程，E-mail：934952552@qq.com。

*通訊作者:崔堂兵(1967-)，男，博士，教授，研究方向：發酵工程、酶工程、生物制藥等，E-mail：fetbcui@scut.edu.cn。

廣東省自然科學基金(S2013010013162)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0195-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.029