果蔬中殘留有機磷農藥降解菌的選育及鑒定

梁金鐘,梅劍秋,王翼雪

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

果蔬中殘留有機磷農藥降解菌的選育及鑒定

梁金鐘,梅劍秋,王翼雪

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

為減少果蔬中的農藥殘留量,利用96孔板從長期噴灑農藥的耕地土壤中篩選出一株能高效降解有機磷農藥的菌株,并對其進行形態學及生理生化鑒定,提取其基因組并與GenBank上已提交的26S rDNA進行BLAST比對,結果表明,其歸屬于紅酵母菌屬(Rhodotorulasp.)。由MEGA6.0軟件構建的系統發育樹結果表明,該菌株與Rhodotorulamucilaginosa26S rDNA序列一致性可達99%,結果與生理生化實驗相一致。因此,確定該菌株為膠紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa),編號為RM-DY21。利用紫外分光光度法測定該菌株32 h內對毒死蜱(50 mg/L)降解率為70.04%。該菌株在以有機磷農藥(毒死蜱、氧樂果和敵百蟲)為唯一碳源的培養基中生長效果好,說明其對這三種農藥均有降解效果,可以廣泛降解有機磷農藥。

有機磷農藥,土壤,降解菌,26S rDNA

隨著農業的發展,農作物對農藥的依賴性不斷增強,導致果蔬中農藥殘留超標中毒事件時有發生,怎樣降低農藥殘留量引起的危害,己受到國內外的廣泛關注。如今果蔬產品的質量與安全問題日益受到消費者的重視與關注,安全無農藥殘留的果蔬受到追捧。但有機磷農藥在農業生產過程中的使用仍占主導地位,在短期內難以改變[1]。僅依靠有機磷農藥自然降解已無法滿足人們對食品安全的要求。殘留農藥的降解是降低農藥毒副作用的一個重要研究領域[2]。

有機磷農藥降解方法有物理方法、化學方法和生物方法。物理方法包括吸附法、超聲波法和洗滌法,化學方法包括氧化法、還原法和水解法,這兩種方法成本高、可能產生新的污染物[3],且處理過程中反應需要苛刻的條件[4]。微生物對有機磷的降解包含多種酶促反應,具有無毒、無二次污染,反應速度快、條件溫和等優點,是近年來應用范圍最為廣泛的一種方法,也是目前較為成熟的一種應用方法[5]。因此,篩選高效、廣譜的有機磷農藥降解菌株具有重要意義[6]。

有機磷農藥通常是指磷酸酯或硫代磷酸酯等這類磷化物[7]。已報道的大部分微生物僅專一性降解含P=O鍵或P=S鍵類的有機磷農藥,降解范圍具有局限性,而且降解率較低[8-12],因此本課題旨篩選出高效廣譜降解有機磷農藥菌種以解決果蔬中殘留有機磷農藥的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣 于2015年9月采自鶴崗市某長期噴灑農藥的大豆耕地土壤;毒死蜱乳油(50 g/100 mL) 浙江新農化工股份有限公司;氧樂果乳油(40 g/100 mL) 鄭州蘭博爾科技有限公司;敵百蟲原藥(90 g/100 mL) 山東大成農藥股份有限公司;Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

5100紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;723N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;DZP-102恒溫振蕩器 中國·哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;H1650-W臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;Motic BA200顯微鏡 上海儀園光學儀器廠;S-3400掃描電鏡 天美日立公司;JY5000電泳儀 北京市君意機電技術公司;T100-PCR擴增儀 杭州博日科技有限公司;SIM凝膠成像系統 百維信生物科技有限公司。

1.2 培養基的配制

1.2.1 完全培養基的配制 KNO33.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4.7H2O 0.5 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L,自然pH[13]。

1.2.2 選擇培養基的配制 MgSO4·7H2O 0.500 g/L、K2HPO41.310 g/L、FeSO4·7H2O 0.018 g/L、NaNO33.000 g/L、KCl 0.500 g/L[14]。其中加入一定量的有機磷農藥作為唯一碳源。

1.2.3 YPD培養基的配制 葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、酵母浸粉10.0 g/L,自然pH。

1.3 菌株的分離篩選

從長期噴灑農藥的耕地取1 g土壤溶于10 mL生理鹽水中,搖勻后取上清液分別用生理鹽水梯度稀釋,并選取濃度為10-2、10-4、10-6稀釋液分別涂布于加有50 mg/L毒死蜱的選擇培養基平板中,35 ℃倒置培養48 h。將平板上所生長的菌落分別挑至加有100 mg/L毒死蜱的選擇培養基的96孔深孔板中,35 ℃恒溫培養48 h后,分別取0.1 mL菌液涂布于完全培養基平板中,35 ℃倒置培養24 h,再從中挑取單一菌落于含有200 mg/L毒死蜱的選擇培養基的試管中,依次梯度增加毒死蜱濃度至10000 mg/L,從而篩選出具有高耐藥性的菌株。

1.4 標準曲線的繪制

用石油醚配制濃度為20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 mg/L的毒死蜱,在293 nm波長下測定,以石油醚為參比;然后根據濃度和吸光值作出標準曲線[15]。以毒死蜱濃度為橫坐標(x)、以毒死蜱在293 nm處吸光值為縱坐標(y)繪制標準曲線,得到回歸方程為y=0.00218x+0.0065,相關系數為R2=0.99911,回歸性較好。

1.5 高效降解菌株的確定

將篩選出的幾株高耐藥性菌株分別接種于20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 mg/L的不同濃度毒死蜱的液體選擇培養基中,以不接種菌株作為空白對照組,重復3次。35 ℃,150 r/min恒溫振蕩培養48 h,分別取5 mL發酵液用等體積石油醚萃取,采用紫外分光光度法在最大吸收峰λ=293處測定吸光值,然后從標準曲線上查出所對應的濃度[15],計算降解率。選取50 mg/L毒死蜱為目標濃度,將幾株高耐藥性菌株接種于其中,分別測定其降解率,以確定高效降解菌。

式中:X為毒死蜱在液體培養基中的降解率(%);Cck為對照樣品中農藥的含量(mg/L);Cx為處理樣品中藥劑的含量(mg/L)。

1.6 菌株的鑒定

1.6.1 菌株的形態學鑒定 觀察單個菌落的顏色、形狀、透明度、光滑、濕潤和邊緣整齊等特征[16]。做簡單染色在100倍油鏡下觀察[17]。

取一定的培養液,8000 r/min離心3～5 min,棄上清液,加入2.5%戊二醛固定2 h,pH7.2磷酸鹽緩沖液清洗,然后加入蒸餾水稀釋,充分混合后用滴管取混合液一滴于小塊蓋玻片上,吸附2 min,用濾紙吸去多余溶液。然后用雙面膠將此蓋玻片貼在棕色瓶瓶蓋內壁,在棕色瓶內加入適量1%鋨酸,蓋上含有樣品的瓶蓋,熏蒸固定2 h以上。然后用雙面膠將蓋玻片粘在樣品臺上,噴金,進行掃描電鏡觀察[18]。

1.6.2 菌株的生理生化鑒定 根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》和《微生物分類學》對菌種進行生理生化鑒定[19-21]。

1.6.3 野生菌株基因組的提取 采用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取菌株的26S rDNA。

1.6.4 菌株26S rDNA聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增 使用引物 NL1(GCATATC AATAAGCGGAGGAAAAG)和NL4(GGTCCGTGT TTCAAGACGG)通過PCR儀擴增菌株的26S rDNA近5′端的D1/D2區域。

反應體系:DNA模板1.2 μL引物NL1 1.2 μL,引物NL4 1.2 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.4 μL,10×PCR緩沖液6 μL,Taq DNA聚合酶(Hifi)0.6 μL,ddH2O 47.4 μL,總反應體積為60 μL,混勻后快速離心15 s。

PCR擴增條件為:95 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,52 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 20 s;循環36次,72 ℃ 8 min;PCR產物4 ℃保存。

PCR反應產物的瓊脂糖電泳檢測:取5 μL PCR擴增產物點樣于1%瓊脂糖凝膠,于150 V電壓下電泳20 min,記錄凝膠成像結果[22]。

1.6.5 菌株26S rDNA序列比對分析及系統發育樹的構建 將菌株的26S rDNA PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序結果在NCBI(網址:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的GenBank庫中與已有序列經Blast比對后分析,并利用MEGA6.0軟件構建系統發育樹[23]。

1.7 菌株降解有機磷農藥的廣譜性測定

選取目前果蔬種植中常用的農藥樂果、毒死蜱、敵百蟲作為目標農藥,將菌株分別接種在以50 mg/L毒死蜱、氧樂果、敵百蟲為唯一碳源的選擇培養基中,于28 ℃搖床培養2 d后,涂布于完全培養基的平板上,28 ℃倒置培養2 d,觀察菌落生長情況。若生長良好則具有一定降解能力,若不生長則不具有降解能力[24]。

1.8 菌株的生長曲線及降解曲線

1.8.1 菌株的生長曲線測定 將菌株按2%接種量接種于YPD培養基中,28 ℃恒溫搖床震蕩培養,每2 h取樣并在600 nm 處測定培養基中菌的濁值,以時間為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制菌株的生長曲線。

1.8.2 菌株對有機磷農藥的降解曲線測定 配制毒死蜱含量為50 mg/L的YPD培養基,將預先制備好的OD400在1.0的菌懸液,按2%的接菌量接種。28 ℃,150 r/min下振蕩培養,定時取樣,測定毒死蜱的殘留濃度,于紫外分光光度計中測其在最大吸收峰293 nm處的吸光度值,對照標準曲線得出底物中毒死蜱殘留量,求出降解率。以培養液中毒死蜱的濃度為縱坐標,取樣時間為橫坐標,繪制毒死蜱的降解曲線。

1.9 數據處理

實驗中每組數值重復處理3次,利用Excel 2010軟件進行數據處理并作圖,利用MEGA 6.0軟件進行系統發育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 有機磷農藥降解菌的篩選

2.1.1 高耐受有機磷農藥菌株的篩選 通過選擇培養基從土壤中獲得300多株耐藥菌株,經梯度增加培養基中毒死蜱濃度至10000 mg/L,最終獲得編號為DY21、LY12、LY11、DS52和LY41的5株高耐菌株。

2.1.2 高效降解有機磷農藥菌株的篩選 如圖1(a)所示。比較5株不同菌株的降解率,可以看出在毒死蜱濃度為20 mg/L時菌株降解率均比較高,從毒死蜱濃度在20～40 mg/L時菌株降解率開始急速下降。當毒死蜱40～200 mg/L之間時,菌株DY21的降解率基本保持平穩,波動較小。菌株LY12在60 mg/L時降解率顯著增高,但從80 mg/L開始降解率逐漸降低,在濃度為180～200 mg/L時顯著降低。菌株DS52降解率不穩定,在160 mg/L開始顯著下降。菌株LY11和LY41降解率比較穩定,但其降解率明顯低于菌株DY21。

如圖1(b)所示,本實驗選取毒死蜱濃度為50 mg/L進行研究,降解32 h后5株菌株的降解率分別為70.04%、68.52%、54.55%、60.26%和64.18%,最終確定一株高效降解菌為菌株DY21。

圖1 不同菌株對毒死蜱降解率比較Fig. 1 Comparisons of degradation rate of chlorpyrifos among different strains

2.2 菌株的形態學及生理生化鑒定

2.2.1 菌株的菌落形態 由圖2可知,肉眼觀察YPD平板上DY21菌落呈橘紅色、色澤鮮艷、顏色均一、正反面顏色一致,表面光滑、濕潤,邊緣整齊,易挑起,呈圓形、不透明、無褶皺。

圖2 菌落形態圖Fig.2 Colonies of strain-DY21

2.2.2 菌株的細胞形態 利用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察菌株DY21,結果如圖3、圖4所示,菌株排列整齊,細胞呈橢圓形,以出芽方式繁殖,無子囊孢子,無擲孢子,大小在20.26 μm×13.02 μm左右。

2.2.3 菌株的生理生化鑒定 從表1可知,菌株DY21可以利用葡萄糖、棉子糖、D-木糖、木糖醇、海藻糖、核糖醇;不能利用D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、松三糖、蜜二糖、乳糖、淀粉、硝酸鹽;可與L-山梨糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-核糖發生可變反應。尿素水解實驗呈陽性,說明該菌株具有水解尿素的酶,可以產生大量的氨,使培養基呈堿性;醋酸產生實驗呈陰性,說明該菌株不產酸;DDB實驗呈陰性。

表1 生理生化實驗結果

圖3 光鏡1000×下的菌株DY21的形態Fig.3 The morphological characteristics of the strains under light microscope 1000×

圖4 掃描電鏡5000×下的菌株DY21的形態Fig.4 The morphology of strain DY21 under scanning electron microscope 5000×

注:“+”為陽性反應;“-”為陰性反應;“V”為可變反應。

2.2.4 26S rDNA序列比對分析及分子生物學鑒定

2.2.4.1 菌株DY21基因組的提取及其26S rDNA的擴增 將菌株DY21提取的基因組為模板,采用通用引物擴增26S rDNA。由圖5可知,菌株DY21的26S rDNA PCR擴增產物出現一條亮帶,其分子質量為500 bp左右。

圖5 菌株DY21的26S rDNA擴增譜帶Fig.5 Amplified rDNA 16S bands from strain DY21

2.2.4.2 26S rDNA序列比對分析及系統發育樹構建 菌株DY21的26S rDNA序列與已公布序列一致性均達99%,隨機選取其中10株酵母菌用MEGA6.0軟件進行系統發育樹的構建,如圖6所示。

圖6 菌株RM-DY21系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain RM-DY21

由系統發育樹(圖6)可知,野生菌株DY21與已報道的膠紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)親緣性一致,比對一致性均為99%,參照生理生化實驗結果,將DY21菌株定名為RhodotorulamucilaginosaDY21,簡寫為RM-DY21。

2.3 菌株RM-DY21降解有機磷農藥的廣譜性測定

有機磷農藥通過其磷脂鍵的破壞而脫毒,由于各有機磷農藥的結構相似,只是取代基不同,所以通常一種菌種可以降解多種有機磷農藥。所以本實驗選取了3種有代表性的有機磷農藥進行菌種降解實驗,通過觀察涂布后固體培養基中菌株的生長狀況,菌株生長越好說明其對有機磷農藥的降解效果越好(圖7～圖9),其中毒死蜱中菌落較為密集,氧樂果次之,敵百蟲中較少,說明菌株對這三種農藥均能降解,其中對毒死蜱降解效果最好,對氧樂果降解效果次之,對敵百蟲降解效果一般。故說明該菌株對有機磷農藥的降解具有一定的廣譜性。菌株RM-DY21與劉斌斌等篩選出的魯氏酵母菌(Saccharomycesrouxii)相比，具有降解效果廣泛的優點[25]。

圖7 毒死蜱中菌株RM-DY21生長形態Fig.7 RM-DY21 strain growth morphology in chlorpyrifos

圖8 樂果中菌株RM-DY21生長形態Fig.8 RM-DY21 strain growth morphology in dimethoate

圖9 敵百蟲中菌株RM-DY21生長形態Fig. 9 RM-DY21 strain growth morphology in dipterex

2.4 菌株RM-DY21的生長曲線及其對毒死蜱的降解曲線

由圖10可知,在YPD培養基中菌株RM-DY21適應期長,生長緩慢,38 h后生長趨勢相對穩定。隨著菌株的生長對毒死蜱的降解率也逐漸提高,在32 h后對毒死蜱的降解趨于穩定。

圖10 菌株RM-DY21的生長曲線及其對有機磷農藥的降解曲線Fig.10 Growth curve of strain RM-DY21 and its degradation curve of organic phosphorus pesticide

3 結論

本實驗從長期噴灑農藥的土壤中篩選出300多株菌株,經96孔板初篩選出5株耐高濃度有機磷農藥的菌株。采用紫外分光光度法測定5株菌株對有機磷農藥的降解率,復篩選出一株降解率最高的菌株,編號為RM-DY21,該菌株作用32 h后對50 mg/L毒死蜱的降解率為70.04%。對RM-DY21進行形態學、生理生化鑒定并與GenBank上已提交的26S rDNA進行BLAST比對,表明其歸屬于紅酵母菌(Rhodotorulasp.)屬。由MEGA6.0軟件構建的系統發育樹結果表明,菌株與Rhodotorulamucilaginosa26S rDNA序列一致性達99%,與生理生化實驗結果一致,確定該菌株為膠紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)。將菌株涂布于以有機磷農藥為唯一碳源的固體培養基中,菌株生長越好說明其對有機磷農藥的降解效果越好,其中毒死蜱中菌落較為密集,氧樂果次之,敵百蟲中較少,說明菌株對毒死蜱降解效果最好,對氧樂果降解效果次之,對敵百蟲降解效果一般,證明該菌株對降解有機磷農藥具有一定的廣譜性。本實驗篩選出的膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa),其降解率與已報道的假單胞菌(Pseudomonas)、不動桿菌(Acinetobacter)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等[26]相比有一定的提高且降解效率高。膠紅酵母菌無毒無害,富含多種氨基酸和脂肪酸,營養成分高,可作為降解有機磷農藥菌劑的優質原料。在后續實驗中可通過誘變育種、發酵工藝條件優化以及提取精制菌株降解酶等手段提高其對有機磷農藥的降解率,也可利用分子生物學技術提取有機磷降解酶基因,為構建基因工程菌奠定基礎,實現降解酶的產業化生產。

[1]張廣志,張新建,扈進冬,等. 有機磷農藥降解菌的篩選及降解能力測定[J]. 河南農業科學,2009(3):63-65.

[2]鄧曉,李勤奮. 產后果蔬農藥殘留降解技術研究[J]. 安徽農學通報,2007(18):34-37.

[3]Beate R,Fei Y. Parkinson’s disease mortality and pesticide exposure in California 1984-1994[J]. International Journal of Epidemiology,2000(29):323-329.

[4]李文華. 毒死蜱降解菌的分離、篩選及其降解條件的優化[D].泰安:山東農業大學,2013.

[5]段海明. 毒死蜱降解細菌的篩選、降解特性及其固定化研究[D]. 泰安:山東農業大學,2011.

[6]張六六,夏森玉,丁亞欣,等. 有機磷農藥高效降解微生物的篩選與鑒定[J]. 安徽農業科學,2015(36):212-215,253.

[7]孟慶林,梁金鐘,王風青. 果蔬中殘留毒死蜱農藥降解菌的選育及鑒定[J]. 食品與發酵工業,2016,42(4):108-113.

[8]傅澤田,祁力鈞. 國內外農藥使用狀況及解決農藥超量使用問題的途徑[J]. 農業工程學報,1998(2):13-18.

[9]Kapoor M,Rajagopal R. Enzymatic bioremediation of organophosphorus insecticides by recombinant organophosphorous hydrolase[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2011(65):896-901.

[10]陳少華,羅建軍,胡美英,等. 一株擬除蟲菊酯農藥降解菌的分離鑒定及其降解特性與途徑[J]. 環境科學學報,2011(8):1616-1626.

[11]夏志光,李雪峰,郭丹,等. 氧化樂果降解菌的篩選與鑒定[J]. 防護林科技,2014(10):34-37.

[12]Kulshrestha G,Kumari A. Fungal degradation of chlorpyrifos byAcremoniumsp. Strain(GFRC-1)isolated from a laboratory-enriched red agricultural soil[J]. Biol Fertil Soils,2011(47):219-225.

[13]鄧曉,李勤奮,侯憲文,等. 樂果降解菌LGX1的篩選及其降解特性研究[J]. 生態環境學報,2010(5):1034-1039.

[14]謝鳳行,張峰峰,周可,等. 水質凈化酵母菌的分離篩選及鑒定[J]. 微生物學報,2015(5):635-642.

[15]王金花. 毒死蜱降解微生物的篩選及其降解特性研究[D]. 泰安:山東農業大學,2004.

[16]趙紫華,韓雪,王玉營,等. 一株高產β-胡蘿卜素紅酵母菌株的篩選及發酵工藝研究[J]. 飼料研究,2015(5):10-14，18.

[17]陸振群. 酒曲中生香酵母的分離及生理生化鑒定[J]. 釀酒科技,2012(3):37-39.

[18]Watson L P. Preparation of microbiological specimens for scanning electron microscopy[J]. SEM 1980(П):303.

[19]胡瑞卿. 酵母菌的特征與鑒定手冊[M]. 青島:青島海洋大學出版社,1991:11-14.

[20]Barnett JA,Payne RW,Yarrow D. Yeasts:Characteristics and Identification(Third Edition.)[M].Netherlands:Springer Netherlands,2001.

[21]張紀忠. 微生物分類學[M]. 上海:復旦大學出版社,1990:240-255.

[22]Barros D E,Lopes M A,Soden A,et al. Differentation and species identification of yeast using PCR[J]. Int J Syst Bacte roil,1998(48):279-286

[23]張麗娜,榮昌鶴,何遠,等. 常用系統發育樹構建算法和軟件鳥瞰[J]. 動物學研究,2013(6):640-650.

[24]羅源華. 有機磷農藥微生物降解菌的分離與鑒定[D].長沙:湖南農業大學,2005.

[25]劉斌斌,趙永芳,鈔亞鵬,等. 魯氏酵母菌WY-3降解甲胺磷的性能[J]. 環境科學,2001,22(4):37-41.

[25]金瀟,顏冬云,秦文秀. 有機磷農藥的微生物降解技術[J]. 湖南農業科學,2011(9):93-97.

Screening and identification of the degradation bacteria of residues chlorpyrifos pesticide on fruits and vegetables

LIANG Jin-zhong,MEI Jian-qiu,WANG Yi-xue

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

To reduce the residues of pesticide in fruits and vegetables,a strain efficiently degrading organophosphorus pesticides was obtained through 96-well plates-based screening from soil of cultivated land under long-term spraying of pesticide. Analysis of morphology,physiological and biochemical properties,and BLAST of 26S rDNA sequences in GenBank indicated that the strain belonged toRhodotorulagenus. The identity of 26S rDNA between this strain withRhodotorulamucilaginosawas 99% through the analysis of phylogenetic tree generated by MEGA6.0 software,consistent with the analysis of physiological and biochemical experiments. Therefore,the strain was determined asRhodotorulamucilaginosaand numbered RM-DY21. The degradation rate of RM-DY21 to chlorpyrifos was 70.04% in dosage of 50 mg/L in 32 h using the UV spectrophotometric method. RM-DY21 grew better in the medium of organophosphorus pesticide which was the single carbon source,showing its better degradation for organophosphorus pesticide. Because of its obvious degradation of chlorpyrifos,omethoate and dipterex,RM-DY21could be a wide degradation of organophosphorus pesticides.

organophosphorus pesticides;soil;degradation bacteria;26S rDNA

2016-10-11

梁金鐘(1957-)，男，本科，教授，研究方向：微生物學與發酵工程，E-mail:Ljz2050@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.028