構建用于相關基因篩選的微小亞歷山大藻產(chǎn)毒株基因組文庫

楊翠琪,趙力超,2,李 獻,王 麗,2,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642;2.暨南大學食品安全與營養(yǎng)研究院,廣東廣州 510632)

構建用于相關基因篩選的微小亞歷山大藻產(chǎn)毒株基因組文庫

楊翠琪1,趙力超1,2,李 獻1,王 麗1,2,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642;2.暨南大學食品安全與營養(yǎng)研究院,廣東廣州 510632)

麻痹性貝毒素(paralytic shellfish poisonings,PSP)嚴重威脅海產(chǎn)食品質(zhì)量安全,其主要是由水體中的甲藻代謝產(chǎn)生。利用分子生物學和生物信息學技術構建微小亞歷山大藻ATMW02基因組文庫,探求與PSP產(chǎn)生相關的基因群。經(jīng)過與無毒亞歷山大藻L35對比篩選,獲得ATMW02株系特異性的DNA片段,然后,利用反向PCR擴展該片段的旁側(cè)序列,分析其序列特征和功能,探討有可能引起藻株致毒的關鍵酶。通過序列分析獲得一段去除了內(nèi)含子的240 bp大小的核苷酸序列,這條核苷酸序列在終止密碼子之外的非編碼區(qū)突變了三個堿基,并且存在三個非常保守的銅離子結合區(qū)。其對應的氨基酸序列翻譯的對象是甲硫氨酰氨肽酶(methionine amino peptidase,MAP),氨基酸比對分析,其與芬地亞歷山大藻MAP氨基酸序列相似性達到97%。研究結果為深入研究亞歷山大藻產(chǎn)毒機制奠定了理論基礎,同時,為加強海產(chǎn)品監(jiān)控和質(zhì)量安全提供有力的技術支持。

亞歷山大藻,麻痹性貝毒素,基因組文庫,分子生物學

海洋中的某些藻類,例如有毒亞歷山大藻(Alexandrium),其分泌的有毒物質(zhì)-麻痹性貝毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP),是目前分布最廣、危害最大的一種藻毒素[1],在魚、蝦、貝類等生物體內(nèi)蓄積,對海產(chǎn)品安全有嚴重影響[2]。PSP會麻痹人的神經(jīng),輕度中毒會出現(xiàn)口唇部位發(fā)麻,重則引發(fā)呼吸困難、心臟功能紊亂?，F(xiàn)已知海洋中有13種單細胞甲藻可產(chǎn)生麻痹貝毒素,我國沿海發(fā)現(xiàn)的有毒甲藻主要有三種[3]:貝瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)、微小亞歷山大藻(Alexandriumminudum)、鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumacatenella)。隨著基因工程技術的迅速發(fā)展,人們對生物體基因的結構、功能表達及其調(diào)控機理的研究逐漸深入到分子水平,構建基因組文庫己成為遺傳研究實驗室的常規(guī)策略。它對于分離特定的基因片段,研究基因的表達調(diào)控、基因組的結構和功能,以及人類和動植物的基因組工程等都有極其重要的作用。

大量的生理生態(tài)學和遺傳學研究結果認為,毒素基因具有成塊性,一旦某個特定毒素合成的基因被定位,可以采用某些分子生物學手段,如基于PCR 的引物步移(Primer walking PCR)法分離出完整的毒素合成基因組?，F(xiàn)在已經(jīng)知道一個基因的表達在很大程度上是由它的旁側(cè)序列調(diào)控的,克隆基因的旁側(cè)序列已經(jīng)成為分子生物學研究中的常規(guī)工作之一。在測定已知基因片段的旁側(cè)基因序列方法上,常用的有染色體DNA步移、錨定引物PCR、加入銜接頭等方法[4-8]。其中應用染色體DNA步移的方法以其準確性高而常用。反向PCR技術是DNA步移方法的一種,它可以對一個已知序列DNA的兩側(cè)未知序列進行擴增和研究,在分子生物學研究中有廣泛應用。

構建亞歷山大藻產(chǎn)毒株基因組文庫并從中篩選與毒素產(chǎn)生相關的基因片段,可為采取對應措施提供背景知識。一般認為,麻痹性貝毒素的表達受中間合成酶的影響,有基因群參與其中[9-10]。通過研究產(chǎn)毒株與無毒株的基因差別來了解PSP相關基因群。目前已經(jīng)分離得到產(chǎn)毒株微小亞歷山大藻ATMW02和無毒株L35。本文通過構建微小亞歷山大藻ATMW02的基因組文庫,使其含有與PSP產(chǎn)生相關基因群,經(jīng)過與無毒株L35對比篩選,獲得ATMW02株系特異性的DNA片段,然后,利用反向PCR研究特異性片段的旁側(cè)序列,分析其序列特征和功能,探討有可能引起藻株致毒的關鍵酶,進一步驗證與PSP毒素產(chǎn)生的關系。研究結果將對有毒藻產(chǎn)毒機理或者產(chǎn)毒藻株的快速基因鑒定具有理論參考作用,同時對保障海產(chǎn)品消費安全至關重要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白酶K、Taq酶、T4連接酶、Ex Taq DNA聚合酶 大連寶生物公司;Xho I、Sau3AI、Hind III酶 Takara生物技術有限公司;DNA凝膠純化試劑盒 美國MBI公司;DGL2000 DNA分子量標準 北京鼎國生物技術有限責任公司;X-Gal、IPTG、氨芐青霉素 北京鼎國生物技術有限責任公司;PMD-18T質(zhì)粒、有毒微小亞歷山大藻ATMW02和無毒塔瑪亞歷山大藻L35 由暨南大學水生生物研究所提供;大腸桿菌DH5α鼎國生物工程有限公司,甘油凍存在-80 ℃;甘油 上海生工生物工程有限公司,分析純;f/2培養(yǎng)基 參考文獻[11]配制。

GeneAmp PCR system 9700PCR儀 美國ABI應用生物系統(tǒng)公司;WFH-20ZB紫外投射分析儀 上海精科實業(yè)有限公司;FC-16C高速冷凍臺式離心機 方統(tǒng)生物技術有限公司;GE-100核酸電泳儀 杭州生物科技有限公司;Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗藻株處理

藻種的鑒定已通過光學顯微鏡及掃描電鏡形態(tài)觀察,結合rDNA序列比較等方法確定。單藻種培養(yǎng)在含500 mL f/2培養(yǎng)液的1000 mL錐形瓶中,接種密度約為160 cells/mL,培養(yǎng)溫度(20±1) ℃,光照強度為100 μmol photons/(m2·s),由白色熒光燈供光,光∶暗=12 h∶12 h。每天定時晃動錐形瓶2次,每周更換培養(yǎng)基1次。每天早上9:00,取藻液滴于浮游生物計數(shù)框上,在光學顯微鏡下鏡檢計數(shù)。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞歷山大藻基因組DNA提取 利用凍融-CTAB方法提取基因組DNA[11]。

1.3.2 插入片段制備 在滅菌的、潔凈的PCR反應管中,用限制性內(nèi)切酶Sau3A I部分酶切基因組DNA,酶切體系見表1。

表1 亞歷山大藻基因組DNA酶切體系

輕混后,37 ℃酶切2 h后,75 ℃、15 min失活Sau3AI酶。酶切結束后用等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次,氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次,小心吸出水相并加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉(pH5.2)和兩倍體積的冰預冷的無水乙醇,于-20 ℃中靜置數(shù)小時。然后在4 ℃下最大轉(zhuǎn)速離心,沉淀用冰預冷的70%乙醇洗一次,待乙醇揮發(fā)完全后,溶于適量無菌超純水中保存于-20 ℃。

1.3.3 酶解DNA片段克隆至T載體

1.3.3.1 插入片段的量 連接反應中需要的插入片段的量采用以下公式:

插入片段的量(ng)=加入載入載體的量(ng)×插入片段的大小(kb)×插入片段和載體的摩爾比/載體大小

式中的PMD-18T載體系統(tǒng)插入的DNA片段和載體的摩爾比3∶1的連接比例。加入載入載體的量為50 ng。插入片段大小為200 bp～2 kb。載體大小為2.6 kb,濃度為50 ng/μL。

1.3.3.2 插入片段與供體載體的體外連接 反應前將2×快速連接緩沖液混勻,在滅菌的0.2 mL PCR反應管中依次按照表2加入組分。

連接反應:在16 ℃條件下,反應過夜。

表2 連接反應體系

1.3.4 制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞 參照文獻[11]。

1.3.5 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取 在過夜培養(yǎng)的生長有白色菌落和藍色菌落LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上,用無菌的接種針挑取白色菌落,接種在含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,在相應的每個白色菌落做上標記。提取質(zhì)粒,通過凝膠電泳確認是否含有質(zhì)粒及其質(zhì)粒的大小。

1.3.6 序列測定及特異性鑒定 將提取的含有插入片段的質(zhì)粒進行序列測定,去除質(zhì)粒本身DNA序列,得到插入片段的DNA序列。根據(jù)測序結果,設計合成擴增引物,分別擴增產(chǎn)毒微小亞歷山藻ATMW02和無毒藻塔瑪亞歷山大藻L35基因組DNA,根據(jù)擴增結果進行特異性鑒定。

1.3.7 反向PCR法分析與產(chǎn)毒相關DNA片段上游未知序列 常規(guī)PCR技術是擴增兩個引物之間的DNA片段,而反向PCR是用反向的引物來擴增兩引物之外的DNA片段。其目的是擴增一般已知目的順序旁側(cè)的DNA[9-13]。由于反向PCR可用于研究與已知DNA片段相連的未知DNA序列,因此又被稱為DNA步移。此法所選擇的引物雖與已知DNA序列互補,但兩引物3′端是反向的。反向PCR擴增前,先用限制性內(nèi)切酶酶切DNA,然后用連接酶使帶有粘性末端的DNA片段進行自身環(huán)化,最后用一對反向引物進行PCR擴增,得到的線性DNA將含有兩引物外側(cè)的未知序列,如圖1所示。

圖1 反向PCR擴增特異性片段兩端未知序列原理圖Fig.1 Process of amplification of the two ends of specific DNA fragment by inverse PCR

1.3.7.1 引物設計和限制性內(nèi)切酶選擇 反向PCR中,上游引物應該靠近序列3′端,下游引物應該偏向序列5′端。限制型內(nèi)切酶的酶切位點應該在已知下游序列前,而且必須保證引物之間和上游引物后面無該限制性內(nèi)切酶的酶切位點。另外,限制性內(nèi)切酶的選擇還應該考慮:酶切識別位點不可有簡并位點,因為可能會影響下一步的連接反應;避免選擇稀有的內(nèi)切酶,一來價錢過高,二來往往這種內(nèi)切酶濃度較低,影響酶切效果;盡量避免識別位點較短的內(nèi)切酶,因為酶切后能夠獲得的序列可能過短,需要的目的序列信息過少。在本實驗中,以插入片段序列信息為已知序列的模板,設計反向引物獲得旁側(cè)未知序。

1.3.7.2 限制性內(nèi)切酶酶切消化染色體DNA 酶切消化的反應體系見表3。輕混后,37 ℃反應2 h。反應后將PCR管放于75 ℃,15 min滅活內(nèi)切酶。酶切產(chǎn)物放于-20 ℃或直接進行下一步實驗。

表3 PCR產(chǎn)物酶切反應體系

1.3.7.3 酶切產(chǎn)物的自身環(huán)化 用T4連接酶進行酶切產(chǎn)物的自身連接環(huán)化,反應體系見表4。環(huán)化條件:在PCR儀中16 ℃反應過夜。94 ℃反應15 min,來終止反應。

表4 自身環(huán)化反應體系

1.3.7.4 反向PCR反應 將引物均溶解并稀釋至10 μmol/L濃度。反向PCR反應體系見表5。

表5 反向PCR擴增體系

按照下列程序進行PCR擴增:第一步,94 ℃變性5 min;第二步,按照下列參數(shù)重復30個循環(huán),94 ℃變性0.5 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min;最后延伸72 ℃、7 min。該反應程序是第一類限制性內(nèi)切酶反向PCR程序,其他反向PCR的退火溫度因設計的引物不同而有所改變。

濃度為1%的瓊脂糖進行凝膠電泳,電壓為100 V時間為30 min。

1.3.7.5 擴增片段測序及序列分析 直接將反向PCR的擴增產(chǎn)物進行測序。測序的結果用contig1、chromas進行序列拼接。使用DNATool軟件對DNA序列進行分析,在http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-e.html網(wǎng)站應用BLASTN程序?qū)Λ@得的基因片段進行同源性檢索。用Gene tool軟件去除序列中的內(nèi)含子,然后用計算機軟件BioEdit將拼接后的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。將其他物種的氨基酸序列(來自GenBank)用BioEdit包含的Clustal W package進行多序列對位分析,并預測獲得的該部分氨基酸的二級結構功能位點。

2 結果與分析

2.1 插入片段制備結果

按本文方法,共獲得150 μg亞歷山大藻ATMW02和L35基因組DNA,0.5 μg/μL,A260/A280為1.80,電泳結果表明獲得的基因組DNA為大分子量,質(zhì)量較好。經(jīng)酶切后,DNA大片段被降解,制備的插入片段大小大部分介于200 bp～2 kb之間,連續(xù)片段分布,符合載體插入片段要求。

2.2 插入片段大小

選擇PMD-18T載體系統(tǒng)進行DNA未知片段的克隆,該載體可用于PCR 產(chǎn)物的克隆,含有T7和SP6 RNA聚合酶啟動子,其側(cè)翼和多克隆位點區(qū)相接,多克隆位點區(qū)位于β半乳糖苷酶的α肽編碼區(qū)內(nèi)。α肽插入失活允許在指示培養(yǎng)基用顏色直接篩選重組克隆。插入片段成功克隆至PMD-18T載體中,可阻斷β半乳糖苷酶的編碼序列,因而重組克隆可在指示培養(yǎng)基上通過顏色進行篩選,選擇白斑菌落作為可能的轉(zhuǎn)化子。

在過夜培養(yǎng)的生長有白色菌落和藍色菌落LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上,用無菌的接種針挑取白色菌落,接種在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,在相應的每個白色菌落做上標記。全部提取質(zhì)粒,通過凝膠電泳確認是否含有質(zhì)粒及其質(zhì)粒的大小。陽性質(zhì)粒電泳圖見圖2,具體插入DNA片段大小通過測序分析獲得。

圖2 提取的部分質(zhì)粒電泳圖Fig.2 Partial plasmids extracted from transformants注:1:質(zhì)粒載體;2～11:從平板上挑選的部分白色菌落提取的質(zhì)粒;12:DL4000 Marker。

2.3 序列測定及特異性鑒定結果

通過質(zhì)粒測序,其中獲得一段長度為1014 bp大小的DNA片段。根據(jù)這段序列的測序結果,設計一對引物,分別擴增有毒微小亞歷山大藻ATMW02基因組DNA和無毒塔瑪亞歷山大藻基因組L35的DNA,判斷這段序列的特異性。同時,擴增兩株亞歷山大藻屬特異性核糖體保守區(qū)域。根據(jù)獲得的DNA片段設計的序列特異性引物為:A-U:5′-TAACC GAGGTTAAAGCTAAGC-3′;A-D:5′-GATTCACCG GCAACCCGACT-3′。同時,利用甲藻18S rDNA專一性引物:B-U:5′-TGTGTGAAAGATTAAGCCATG-3′;B-D:5′-ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA-3′,PCR擴增兩株亞歷山大藻ATMW02基因組作為背景對照。根據(jù)獲得的DNA片段設計的引物退火溫度Tm為52 ℃,屬特異性引物退火溫度為55 ℃,擴增結果見圖3,結果顯示引物對為屬特異性引物兩者均有擴增,ATMW02有強烈的擴增反應,而L35沒有擴增跡象。

麻痹性貝毒素(PSP)是一類嘌呤化合物,沒有對應翻譯的核酸序列,是由多種相關基因合成不同的酶,再由酶作用合成PSP。微小亞歷山大藻ATMW02為PSP產(chǎn)毒藻株,應含有PSP產(chǎn)生過程完整的相關基因群,無毒藻株L35則相關基因群至少不完整。因此,分離PSP相關基因群一個特征為相對于無毒藻株的有毒株株系特異性。從圖3結果看出,兩種藻株均可以擴增出甲藻專一性DNA片段。而利用本文獲得的特異性DNA片段設計的引物可以在ATMW02基因組中擴增出1000 bp左右大小的特異性條帶有強烈擴增信號,而在L35基因組中不能擴增出相應的特異性條帶,說明這段序列具有產(chǎn)毒株特異性,可能為產(chǎn)麻痹性貝毒素(PSP)相關的DNA片段。兩種藻株中都能擴增的條帶說明是亞歷山大藻背景條帶,與PSP毒素產(chǎn)生關系不大。

圖3 篩選片段的ATMW02與L35的株系特異性Fig. 3 Strain specificity of gene fragment between ATMW02 and L35注:1、2:引物對為屬特異性引物;3、4:引物對為本文分析序列。

2.4 反向PCR引物設計與限制性內(nèi)切酶選擇

已知特異性DNA片段可能與產(chǎn)毒有關,通過反向PCR方法探知其旁側(cè)DNA序列,尋找與產(chǎn)毒相關的基因群。對特異性片段DNA序列分析后選擇AsuII和XhoI 這兩種限制性內(nèi)切酶分別對特異性DNA片段進行酶切。酶切后,兩個粘性末端會結合成環(huán),未知的DNA序列環(huán)于環(huán)中。根據(jù)酶切位點設計引物,引物與已知DNA序列互補,但兩引物3′端是反向的。針對限制性酶AsuII設計的反向PCR引物為:上游引物AsuII-U:5′-TCGCCATCAGTAGTT CGCTC-3′;下游引物AsuII-D:5′-GCAACGAGTTAA ACAACGAG-3′。針對限制性酶XhoI設計的反向PCR引物為:上游引物XhoI-U:5′-TCGGTGCC GCTACTGCCCGC-3′;下游引物XhoI-D:5′-GCACATCCGGTGATCTT GA-3′。序列及引物分析結果見圖4。

圖4 反向PCR引物及內(nèi)切酶分析Fig.4 Primers and endonucleases for inverse PCR注:內(nèi)切酶酶切位點以方框標示,引物序列及方向以箭頭標示。

2.5 反向PCR擴增產(chǎn)物分析

圖7 微小亞歷山大藻ATMW02的MAP部分氨基酸序列與其他物種的比對結果Fig.7 The alignment of partial MAP sequences among five species注:Alexandrium fundyense:AAD20316;Arabidopsis thaliana:AAG33975;Oryza sativa:XP_473849;Bos Taurus:AAI13347.1. 比對結果的方框部分是MAP銅離子結合區(qū)域。

通過反向PCR擴增產(chǎn)毒微小亞歷山大藻A.minitumATMW02特異性DNA片段兩側(cè)未知區(qū)域,其中利用AsuII酶得到750 bp左右的片段,利用XhoI酶得到1.0 kb左右的片段。將反向PCR產(chǎn)物送至測序,測序結果分別是755 bp和1100 bp。將所得的兩段DNA序列與之前得到的特異性片段進行拼接并去除其中內(nèi)含子,獲得一段去除了內(nèi)含子的240 bp大小的核苷酸序列。參照Alexandiumfundyense(芬地亞歷山大藻)的開放閱讀框架[14],利用BioEdit軟件將拼接后的序列翻譯成氨基酸。反向PCR產(chǎn)物電泳圖及序列結構分析結果參見圖5及圖6。

圖5 反向PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Inverse PCR product注:Lane M:DL2000 DNA分子量標準;Lane 1,2:利用AsuII酶得到的反向PCR產(chǎn)物,利用XhoI酶得到的反向PCR產(chǎn)物。

圖6 核苷酸序列分析Fig.6 Nucleotide sequence analysis注:方框中部分是核苷酸序列的氨基酸翻譯產(chǎn)物。

反向PCR擴增結果翻譯的氨基酸序列經(jīng)過在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast比較分析,發(fā)現(xiàn)其中471～710 bp之間一段氨基酸序列翻譯的對象屬于甲硫氨酰氨肽酶(methionine aminopeptidase,MAP)氨基酸序列的一部分,通過序列比對發(fā)現(xiàn),其與芬地亞歷山大藻A.fundyenseMAP的氨基酸序列的相似性為97%,與擬南芥(Arabidopsisthaliana)相似性為53%,與水稻(Oryza sativa)相似性為55%,與牛(Bos Taurus)的相似性為51%(圖7)。

甲硫氨酰氨膚酶(MAP)廣泛存在于從低等到高等的所有生物體中,在蛋白質(zhì)加工過程中負責切除新生膚鏈N端的起始甲硫氨酸,這對于對蛋白質(zhì)的修飾、成熟以及在細胞中的準確定位等極其重要,MAP活性是正常生理功能所必需的。一般在原核生物中,MAP單基因單拷貝就能滿足細胞的正常生理功能,但真核生物中卻至少存在兩種構型的MAP。Taroncher-Oldenburg等利用同步化技術和差異顯示技術,發(fā)現(xiàn),甲硫氨酰胺肽酶有可能參與了麻痹性貝毒素的生物合成,推測其對應的map基因與毒素合成有關,且為表達上調(diào)基因[14]。

MAP具有金屬離子依賴性,已知在A.fundyense中該酶具有5個銅離子結合位點,在本文微小亞歷山大藻ATMW02甲硫氨酰胺肽酶的部分氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)3個區(qū)域,分別為GHG、LEP和EHT,同時也說明這三個區(qū)域在MAP中高度保守。

在http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html網(wǎng)站上,分析這段氨基酸序列的二級結構及其功能位點,發(fā)現(xiàn)該酶具有三個功能區(qū)域,分別是:位于29～34的GTTFTL是N-14烷基化位點(N-myristoylation site);位于47～50的TWDD是酪蛋白激酶II磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylation site);位于57～59的SDR是蛋白激酶磷酸化位點(protein kinase phosphorylation site)。

分析這段核苷酸序列,發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)與已報道的核苷酸序列完全相同,主要區(qū)別在3′端的非編碼區(qū),本研究得到的這段序列在非編碼區(qū)末端突變了三個堿基CAG(見圖6中標下劃線的堿基),并且已報道的研究也發(fā)現(xiàn)差別均在終止密碼子之外的非編碼區(qū)。因此,可以判斷不可能是由同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同加工造成的。據(jù)研究,在微小亞歷山大藻ATMW02中存在至少三個map基因拷貝,它們分別轉(zhuǎn)錄得到三種mapmRNA分子,或者轉(zhuǎn)錄得到兩種mapmRNA后,由反式拼接或者RNA編輯產(chǎn)生第三種mapmRNA[15]。根據(jù)序列同源性MAP分為MAP-I和MAP-II兩類,兩者的區(qū)別在于MAP-II的C端插入了一個約60個氨基酸殘基組成的a螺旋[16],通過分析在本文微小亞歷山大藻ATMW02的C端沒有發(fā)現(xiàn)60個左右的氨基酸插入,所以判斷微小亞歷山大藻A.minitumATMW02的MAP可能為I型酶。

到目前為止,對亞歷山大藻的產(chǎn)毒基因和產(chǎn)毒機制的研究還處于剛起步階段[17-22],產(chǎn)毒基因和具體產(chǎn)毒機制都不清楚。在原核生物中,MAP單基因單拷貝就能滿足細胞的正常生理功能,但是真核生物中卻至少存在兩種構型的MAP。Giglione發(fā)現(xiàn)在細胞的不同空間可能需要不同的MAP酶來執(zhí)行其功能[23]。亞歷山大藻正常生長代謝需要MAP的多個基因拷貝,本研究發(fā)現(xiàn)的這段非編碼區(qū)堿基發(fā)生突變,根據(jù)生物信息學分析,推測其突變可能是由于在生長代謝過程中,MAP執(zhí)行了不同的生理功能需求,在轉(zhuǎn)錄水平上對毒素的產(chǎn)生進行了調(diào)控,map基因通過其編碼產(chǎn)物對其他產(chǎn)毒相關基因進行了誘導,使其具有活性表達,開始毒素合成。

3 結論

本文通過構建微小亞歷山大藻A.minitumATMW02文庫,篩選到具有產(chǎn)毒株陽性而無毒株陰性的株系特異性重組片段,并運用反向PCR方法擴增及測定特異性片段兩端未知DNA片段,同時對獲得序列的特征和功能進行了分析。用稀有限制性內(nèi)切酶Sau3A I酶切微小亞歷山大藻ATMW02基因組DNA,通過插入片段與載體的連接、轉(zhuǎn)化以及平板篩選,獲得一段1014 bp大小的特異性DNA片段。然后通過PCR驗證其在有毒株中有強烈的擴增信號,而在無毒株中無擴增信號,判斷該片段具有產(chǎn)毒株株系特異性。利用反向PCR分析特異性片段旁側(cè)DNA序列信息。通過序列分析獲得其中一段240 bp大小的核苷酸序列,其對應的氨基酸序列翻譯的對象是甲硫氨酰氨肽酶(MAP)。氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn),其與芬地亞歷山大藻MAP氨基酸序列相似性達到97%。獲得的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)存在三個非常保守的銅離子結合區(qū),其二級結構存在三個功能區(qū)域。

本研究對于深入研究藻毒素產(chǎn)生的機理提供了一種新的思路,運用分子生物學手段和生物信息學分析能夠?qū)ο嚓P基因群進行有效解析。研究結果對于快速檢測有毒藻株、安全有效監(jiān)測海產(chǎn)食品、防止污染麻痹性貝毒素污染的海產(chǎn)食品流入市場、保障消費者飲食安全等方面都具有積極的促進作用[24-25]。

[1]陳劍剛,朱炳輝,梁素丹,等. 固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定貝類產(chǎn)品中麻痹性貝類毒素[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2016(1):4-8.

[2]周海霞,韓立民.我國海產(chǎn)品質(zhì)量安全可追溯體系建設問題研究[J].中國漁業(yè)經(jīng)濟,2013,31(1):70-74.

[3]李政菊,胡蓉,吳霓,等. 海南島近岸海域貝類中的麻痹性貝類毒素[J]. 海洋環(huán)境科學,2016(2):168-173,195.

[4]Trinh Q,Xu W T,Shi H,et al. An A-T linker adapter polymerase chain reaction method for chromosome walking without restriction site cloning bias[J]. Analytical Biochemistry,2012,425(1):62-67.

[5]Rudi K,Fossheim T,Jakobsen K S. Restriction cutting independent method for cloning genomic DNA segments outside the boundaries of known sequences[J]. Biotechniques,1999,27(6):1176-1177.

[6]Tamme R,Camp E,Kortschak R D,et al. Nonspecific,nested suppression PCR method for isolation of unknown flanking DNA[J].Biotechniques,2000(5):895-902.

[7]Dastur R S,Kachwala M Y,Khadilkar S V,et al. Identification of deletions and duplications in the Duchenne muscular dystrophy gene and female carrier status in western India using combined methods of multiplex polymerase chain reaction and multiplex ligation-dependent probe amplification[J]. Neurology India,2011,59(6):803-809.

[8]Krishnamurthy V V,Khamo J S,Cho E,et al.Multiplex gene removal by two-step polymerase chain reactions.[J]. Analytical Biochemistry,2015,481:7-9.

[9]樊立靜. 亞歷山大藻生長和產(chǎn)毒相關基因的基礎研究[D]. 青島:中國海洋大學,2006.

[10]董嘯天. 我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)品食品安全保障體系研究[D]. 青島:中國海洋大學,2014.

[11]王麗. 近海食源微生物產(chǎn)毒特性的基因分析及其快速檢測研究[D].廣州:華南理工大學,2008.

[12]Xiao Y H,Luo M,Fang W G,et al. PCR walking in cotton genome using YADE method[J]. Acta Genetica Sinica,2002,29(1):62-66.

[13]Zhang Z,Gurr S J. Walking into the unknown:a ‘step down’ PCR-based technique leading to the direct sequence analysis of flanking genomic DNA[J]. Gene,2000,253(2):145-150.

[14]Taroncher-oldenburg G,Andeson D M. Identification and characterization of three differentially expressed genes,encoding S-adenosylhomocysteine hydrolase,methionine aminopeptidase,and a histone-like protein,in the toxic dinoflagellateAlexandriumfundyense[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(5):2105-2112.

[15]孫乃恩,孫東旭,朱德熙. 分子遺傳學[M]. 南京:南京大學出版社,1990.

[16]Anelia A,Mamoru S,Masahiro S,et al. Molecular cloning,expression and characterization of three distinctive genes encoding methionine aminopeptidases incyanobacteriumSynechocystissp. strain PCC6803[J]. Arch Microbiol,2003,180:185-193.

[17]張樹剛. 亞歷山大藻產(chǎn)毒生理及合成機制研究[D].廈門:廈門大學,2006.

[18]卞中園,楊錫洪,解萬翠,等. 初始密度對微小亞歷山大藻生長及產(chǎn)麻痹性貝類毒素的影響[J]. 水產(chǎn)學報,2013(1):78-85.

[19]黃翔. 鹵蟲對微小亞歷山大藻和塔瑪亞歷山大藻生長及產(chǎn)毒的影響[D].廣州:暨南大學,2013.

[20]黃世玉,王雪虹,張麗莉. 磷濃度對2種有毒亞歷山大藻生長和產(chǎn)毒力的影響[J]. 水生態(tài)學雜志,2012(1):107-111.

[21]李昌偉,馮超,江天久. N、P、Fe、Mn對微小亞歷山大藻生長及產(chǎn)毒的影響[J]. 海洋環(huán)境科學,2014(3):341-345.

[22]毛丹卉,解萬翠,楊錫洪,等. 微小亞歷山大藻中麻痹性貝類毒素的凍融法提取優(yōu)化[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學,2015(13):102-108.

[23]Giglion C,Serero A,Pierre M,et al. Identificaiton of eukaryotic peptide deformylases reveals universality of N-terminal protein processing mechanisms[J]. EMBOJ,2000,19(21):5916-5929.

[24]孔凡洲,徐子鈞,于仁成,等. 黃渤海海域貝類麻痹性貝毒的檢測與分析[J]. 中國海洋大學學報：自然科學版,2007(2):305-309.

[25]于仁誠,周名江. 麻痹性貝毒研究進展[J]. 海洋與湖沼,1998(3):330-338.

Construction of genomic library of strains producingAlexandriumMinudumalgae for the screening of related genes

YANG Cui-qi1,ZHAO Li-chao1,2,LI Xian1,WANG Li1,2,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Institute of Food Safety and Nutrition in Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Paralytic shellfish poison(PSP),which is mainly produced by dinoflagellates of water,is a serious threat to Marine food quality and safety.AlexandriumminutumATMW02 genomic library was built to search the related gene group in PSP by using molecular biology and bioinformatics technology. After compared with non-toxicAlexandriumL35,a specificity fragments of the DNA in ATMW02 was obtained and the flanking sequences were expanded through reverse PCR. By analyzing the sequence features and functions,the key enzymes were explored that migth cause the poison also obtained a 240 bp nucleotide sequence without intron. This nucleotide sequence mutated three bases outside the termination codon and existed three conservative copper-binding domain,which could be translated into MAP and 97% match with theAlexandiumfundyenseMAP. The results of this study provided a theoretical foundation for further research onAlexandriumtoxin-producing mechanisms. In the meantime,it could provided technical support to enhance marine food quality and supervision.

Alexandriumminudum;paralytic shellfish poison;genomic library;molecular biology

2016-07-25

楊翠琪(1995-)，女，大學本科，研究方向：食品科學與工程，E-mail：2744243473@qq.com。

*通訊作者:王麗(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生態(tài)與質(zhì)量安全，E-mail：wangli_scau@scau.edu.cn。

廣東省科技計劃項目(2016A040403103)；國家自然科學基金項目(31301445)；國家星火計劃(2015GA780080)；廣東省級“質(zhì)量工程項目”-精品資源共享課“食品微生物檢驗學”。

TS254.7

A

1002-0306(2017)06-0179-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.026