復(fù)合酶法高效提取海帶中褐藻糖膠

楊曉雪,董學(xué)前,張永剛,王 偉,杜金華,劉建軍,,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271000;2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,山東濟(jì)南 250000)

復(fù)合酶法高效提取海帶中褐藻糖膠

楊曉雪1,董學(xué)前2,張永剛2,王 偉2,杜金華1,劉建軍1,2,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271000;2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,山東濟(jì)南 250000)

本研究以海帶為原料,采用復(fù)合酶法提取其中的褐藻糖膠(Fucoidan),目的是通過優(yōu)化提取條件以及與傳統(tǒng)水提法和其他酶提取法作比較,得到一種高效提取褐藻糖膠的方法。研究表明,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了復(fù)合酶即纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的比例為25∶10∶10∶1∶5;在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,得到的復(fù)合酶提取海帶中褐藻糖膠的最佳條件是復(fù)合酶添加量(以海帶干重計(jì))為4.6%,酶解溫度為59 ℃,pH為4.5,時(shí)間為18 h,料水比為1∶30。根據(jù)優(yōu)化條件得到的褐藻糖膠的得率為2.04%,一次提取率為90.20%,明顯高于已有研究報(bào)道。本研究建立了全新的復(fù)合酶高效提取褐藻糖膠的工藝,為后續(xù)工業(yè)放大提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

褐藻糖膠,復(fù)合酶,海帶,多糖

海帶是一種在低溫海水中生長(zhǎng)的大型海藻類植物,同時(shí)具有良好的食用和藥用價(jià)值[1-2],是目前提取褐藻糖膠的主要原料。褐藻糖膠(Fucoidan)又名巖藻聚糖硫酸酯,主要存在于各種藻類植物中,具有多種生理功能如抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗氧化、降血脂和調(diào)節(jié)免疫[3-7]。在海帶中,褐藻糖膠的主要存在位置是細(xì)胞壁。海帶細(xì)胞壁的主要成分包括纖維素、果膠、半纖維素等,另外還有少量海帶多糖(海藻酸、褐藻糖膠和海帶淀粉)和蛋白質(zhì),其中前三者對(duì)海帶細(xì)胞壁具有骨架支撐作用。褐藻糖膠的含量在不同地域和不同部位的海帶中都有所不同,且隨季節(jié)和生長(zhǎng)期的變化而變化。根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù),海帶中褐藻糖膠的含量為2.26%。近幾年來(lái),由于褐藻糖膠具有多種生物學(xué)活性,其受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注,成為當(dāng)今海洋食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前,從海帶中提取褐藻糖膠的方法主要有熱水提取法、酸提取法、微波輔助法、超聲波提取法和酶法。其中,熱水提取法是制備褐藻糖膠的主要方式,但其耗能多,提取時(shí)間長(zhǎng),得率較低[8],浸提過程中高溫導(dǎo)致褐藻糖膠的活性被破壞;酸提取法能提高褐藻糖膠得率,但能顯著降解褐藻糖膠分子使其生物活性降低[9-10],并且大量的酸性化學(xué)藥品會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染;微波輔助法雖然加熱均勻、選擇性好、提取效率高、節(jié)能環(huán)保,但由于成本較高不易應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn);超聲波提取法與酸提法相比能顯著提高褐藻糖膠的含量,但粗多糖的提取率增幅并不明顯[11-12];酶法與其他提取方法相比條件較為溫和,對(duì)褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)基本沒有破壞作用,易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),隨著酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展成熟,其具有良好的應(yīng)用前景。但目前酶法提取褐藻糖膠的研究尚處于起步階段,研究報(bào)道少,且大部分研究采用單一酶解,綜合效果不具有顯著優(yōu)勢(shì),因此有必要開發(fā)更具顯著優(yōu)勢(shì)的復(fù)合酶解方法。

研究表明海帶細(xì)胞壁的主要成分包括纖維素、果膠、半纖維素、褐藻多糖和少量蛋白質(zhì)等。首先,纖維素、果膠、半纖維素對(duì)海帶細(xì)胞壁具有骨架支撐作用,因此要快速有效的破解海帶細(xì)胞壁以釋放出可溶性的褐藻糖膠,需要有效破壞三者形成的穩(wěn)定胞壁結(jié)構(gòu),所以選擇了纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶;其次,以海帶淀粉為主的褐藻多糖對(duì)褐藻糖膠的提取有一定影響,因此選擇α-淀粉酶除去;最后,少量蛋白質(zhì)對(duì)褐藻糖膠在溶液中的釋放存在一定影響,因此要除去這部分蛋白質(zhì)。研究表明,褐藻糖膠提取時(shí),蛋白酶除蛋白的效果優(yōu)于酸法和Sevage法[13],所以最終選擇酸性蛋白酶,以加速細(xì)胞崩解,有利于目標(biāo)產(chǎn)物的釋放。

本研究通過大量的前期篩選實(shí)驗(yàn)并借鑒前人的研究成果,采用纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶對(duì)海帶進(jìn)行復(fù)合酶解,通過有效破壞海帶細(xì)胞壁穩(wěn)定結(jié)構(gòu)來(lái)高效提取褐藻糖膠,建立全新的復(fù)合酶高效提取褐藻糖膠的工藝,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室小試實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,為后續(xù)工業(yè)放大提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干海帶 購(gòu)于榮成市場(chǎng);纖維素酶(50萬(wàn)U/g)、果膠酶(30萬(wàn)U/g)、木聚糖酶(29萬(wàn)U/g)、酸性蛋白酶(50萬(wàn)U/g) 山東隆科特酶制劑有限公司;α-淀粉酶(1萬(wàn)U/mL) 諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司。

HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠;JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)儀器分析廠;7200型可見分光光度計(jì) 濟(jì)南龍瑞商貿(mào)有限公司;L530多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHK-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;GB-300電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TF-FD-18冷凍干燥機(jī) 上海田楓實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合酶提取工藝 工藝流程:干海帶切塊→浸泡沖洗除雜→調(diào)溫調(diào)pH→加入復(fù)合酶恒溫酶解→打碎→離心除海帶渣→鈣凝→離心除海藻酸鈣→濃縮→除鈣離子→中和→醇沉→減壓抽濾→真空冷凍干燥→粗褐藻糖膠[14]

稱取30 g干海帶浸泡后沖洗除雜,按一定比例的料水比加蒸餾水;放入水浴鍋中,恒溫后調(diào)pH至酸性;加入一定比例的復(fù)合酶(以海帶干重計(jì),下同)恒溫酶解一定時(shí)間;酶解結(jié)束后打碎海帶,4000 r/min離心15 min以除去海帶渣得到上層液;向上層液中邊攪拌邊加入30% CaCl2溶液,放置一段時(shí)間至液體澄清,4000 r/min離心15 min除去海藻酸鈣;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮;向濃縮液中加入20% Na2CO3溶液,攪拌后4000 r/min離心15 min除鈣離子,重復(fù)操作至溶液澄清;用HCl溶液中和已除去鈣離子的清液;用無(wú)水乙醇分級(jí)沉淀,4 ℃靜置過夜;減壓抽濾得到沉淀物,真空冷凍干燥后即為粗褐藻糖膠制品。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 在進(jìn)行復(fù)合酶的單因素實(shí)驗(yàn)過程中,各種酶的基本添加量分別為纖維素酶2.5%、果膠酶0.5%、木聚糖酶0.5%、α-淀粉酶0.04%和酸性蛋白酶0.5%,復(fù)合酶解條件為料水比1∶20、pH4.8～5.0、溫度53 ℃、時(shí)間24 h,分別改變其中一種酶的添加量或一個(gè)酶解條件,其他各酶添加量和酶解條件不變進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取復(fù)合酶添加量、溫度、pH、時(shí)間和料水比5個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L16(45),來(lái)確定復(fù)合酶法提取褐藻糖膠的最佳提取條件,正交實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 褐藻糖膠含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定總糖的含量,菲林滴定法[16]測(cè)定還原糖的含量。褐藻糖膠含量(以多糖含量表示)=總糖-還原糖。

1.3.2 計(jì)算公式 如下：

褐藻糖膠得率(%)=溶液中褐藻糖膠質(zhì)量(g)/干海帶質(zhì)量(g)×100

褐藻糖膠一次提取率(%)=褐藻糖膠得率(%)/海帶中褐藻糖膠含量(%)×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin 8.0作圖分析,正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶添加量單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.1酶法提取工藝的操作要點(diǎn),在其他條件不變的情況下,纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和α-淀粉酶的添加量單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶添加量對(duì)褐藻糖膠得率的影響Fig.1 Effect of diffident enzyme on the yield of fucoidan

在其他條件不變的情況下,由圖1(a)可知,褐藻糖膠得率隨纖維素酶添加量的增加而提高,添加量達(dá)到2.5%后得率增加緩慢，隨后開始下降,由此確定纖維素酶的最佳添加量為2.5%。由圖1(b)可知,褐藻糖膠得率隨果膠酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶添加量的增加而提高,果膠酶和酸性蛋白酶的添加量分別達(dá)到0.5%和1.0%時(shí)得率最大,隨后得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì),由此確定果膠酶和酸性蛋白酶的最佳添加量分別為1.0%和0.5%,木聚糖酶添加量達(dá)到1.0%后得率增加的較為緩慢甚至出現(xiàn)下降的趨勢(shì),由此確定木聚糖酶的最佳添加量為1.0%。由圖1(c)可知,褐藻糖膠得率隨α-淀粉酶添加量的增加而提高,添加量達(dá)到0.1%后得率出現(xiàn)平緩增加的趨勢(shì),由此確定α-淀粉酶的最佳添加量為0.1%。由酶添加量單因素實(shí)驗(yàn)可以得到各種酶添加量的最佳比例,即纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的比例為25∶10∶10∶1∶5。

2.1.2 時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.1酶法提取工藝的操作要點(diǎn),在其他條件不變的情況下,時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)褐藻糖膠得率的影響Fig.2 Effect of time on the yield of fucoidan

由圖2可知,在其他條件不變的情況下,褐藻糖膠得率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到16 h后得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì),由此確定最佳時(shí)間為16 h。

酶解過程中得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長(zhǎng),多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或降解,從而使褐藻糖膠得率下降[17]。

2.1.3 溫度單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.1酶法提取工藝的操作要點(diǎn),在其他條件不變的情況下,溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)褐藻糖膠得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of fucoidan

由圖3可知,在其他條件不變的情況下,褐藻糖膠得率隨酶解溫度增加而提高,當(dāng)酶解溫度達(dá)到59 ℃后得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì),由此確定最佳溫度為59 ℃。從50 ℃開始,溫度升高加快反應(yīng)速度,使褐藻糖膠提取率增加,但由于酶也是一種蛋白質(zhì),過高的溫度會(huì)使酶活性降低甚至失去活性,降低褐藻糖膠得率。

2.1.4 pH單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.1酶法提取工藝的操作要點(diǎn),在其他條件不變的情況下,pH單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)褐藻糖膠得率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of fucoidan

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由圖4可知,在其他條件不變的情況下,褐藻糖膠得率隨pH增加而提高,pH4.5后得率平緩增加,pH4.8后出現(xiàn)下降的趨勢(shì),由此確定最佳pH為4.5。纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶均在酸性條件下有較好的酶解作用,由于在過酸或過堿的條件下,酶的空間結(jié)構(gòu)受到了破壞,影響了與底物的結(jié)合,從而使得褐藻糖膠的提取效果下降[18]。

2.1.5 料水比單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.1酶法提取工藝的操作要點(diǎn),在其他條件不變的情況下,料水比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 料水比對(duì)褐藻糖膠得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the yield of fucoidan

由圖5可知,在其他條件不變的情況下,褐藻糖膠得率隨料水比增加而提高,當(dāng)料水比達(dá)到1∶30時(shí)得率最大,隨后得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì),由此確定最佳料水比為1∶30。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L16(45)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示,正交實(shí)驗(yàn)方差分析如表3所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

注:“*”表示影響顯著(p<0.05)。

由表2中的極差值R可知,五個(gè)因素的主次關(guān)系為:D>A>C>E>B,即時(shí)間>復(fù)合酶添加量>pH>料水比>溫度。由平均值k可以得出,最優(yōu)組合為A2B4C1D3E4,即復(fù)合酶添加量4.6%,酶解溫度59 ℃,pH4.5,時(shí)間18 h,料水比1∶30。由表3可知,復(fù)合酶添加量、pH、時(shí)間和料水比對(duì)褐藻糖膠得率影響顯著。

在以上正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳酶解條件，即復(fù)合酶添加量4.6%、溫度59 ℃、pH4.5、時(shí)間18 h和料水比1∶30下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),得到褐藻糖膠平均得率約為2.04%,一次提取率為90.20%。何云海[19]等用傳統(tǒng)水煮法得到的巖藻聚糖硫酸酯的得率為0.968%,趙前程等[14]通過同步加酶法得到的褐藻糖膠提取率為77.8%。本研究通過五種酶進(jìn)行復(fù)合酶解提取褐藻糖膠,顯著提高了褐藻糖膠的得率和一次提取率,結(jié)果高于其他研究報(bào)道的結(jié)果。

3 結(jié)論

通過酶含量的單因素實(shí)驗(yàn)可以得到各種酶添加量的最佳比例,即纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的比例為25∶10∶10∶1∶5。通過正交實(shí)驗(yàn)得到復(fù)合酶解的最佳條件為復(fù)合酶添加量4.6%,溫度59 ℃,pH4.5,時(shí)間18 h,料水比1∶30,在此條件下,褐藻糖膠得率達(dá)到2.04%,一次提取率達(dá)到90.20%,顯著高于已有研究報(bào)道。后續(xù)將進(jìn)行該復(fù)合酶解方法獲得的褐藻糖膠產(chǎn)品化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)及生理活性的比較研究,分析其與現(xiàn)有褐藻糖膠產(chǎn)品的異同,闡明復(fù)合酶解對(duì)于褐藻糖膠產(chǎn)品性質(zhì)的影響,通過繼續(xù)改進(jìn)優(yōu)化獲得高品質(zhì)的褐藻糖膠產(chǎn)品,為工業(yè)化生產(chǎn)放大奠定良好的基礎(chǔ)。

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Efficient extraction of fucoidan fromLaminariajaponicby compound enzymes

YANG Xiao-xue1,DONG Xue-qian2,ZHANG Yong-gang2,WANG Wei2,DU Jin-hua1,LIU Jian-jun1,2,*

(1.Shandong Agricultural University,Taian 271000,China;2.Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute,Ji’nan 250000,China)

This study was designed to extract the fucoidan fromLaminariajaponicabycompound enzyme. By optimizing the extraction conditions and comparing with traditional extraction method and other enzyme extraction method,our target was to develope an efficient method which might product more fucoidan. According to single factor experiment,the ratio of compound enzyme of cellulase,pectinase,xylanase,α-amylase and acid protease was 25∶10∶10∶1∶5. By using orthogonal test which was based onsingle factor experiment and the variance analysis,the optimal hydrolysis conditions for fucoidan extraction fromLaminariajaponicawere4.6% compound enzyme,extraction temperature of 59 ℃,pH4.5,extraction time of 18 h and solid-liquid ratio 1∶30. Under these conditions,the extraction yield of fucoidan was 2.04% and an extraction rate was 90.20%. It was significantly higher than the existing research reports. This study established a new efficient extraction of fucoidan by compound enzymes,to provide theoretical and practical foundation for further scale-up.

Laminariajaponica;compound enzyme;fucoidan;polysaccharide

2016-07-18

楊曉雪(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工原理與技術(shù)，E-mail：819113180@qq.com。

*通訊作者:劉建軍(1962-)，男，博士，研究員，研究方向：微生物資源開發(fā)，E-mail：liujj-2000@163.com。

山東省科技重大專項(xiàng)支持項(xiàng)目(2015ZDZX05001)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)06-0142-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.019