塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗隱桿線蟲生理活性影響研究

李 萍,米生權,馮亞芳,馮斯文,趙 卓

(北京聯合大學應用文理學院,北京100191)

塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗隱桿線蟲生理活性影響研究

李 萍,米生權*,馮亞芳,馮斯文,趙 卓

(北京聯合大學應用文理學院,北京100191)

目的:探究鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對秀麗隱桿線蟲的壽命、生殖毒性和神經毒性的影響。方法:將L2期秀麗隱桿線蟲暴露于DBP 32.5、131、522 mg/L 3個濃度組、DMSO溶劑對照組和空白對照組中,測定線蟲壽命、生殖能力、移動能力和吞咽頻率的變化。結果:DBP暴露導致秀麗隱桿線蟲的壽命縮短,生殖能力下降,移動能力減慢,吞咽頻率降低,且存在劑量依賴關系。結論:DBP暴露縮短線蟲壽命,造成生殖毒性和神經毒性影響。

秀麗隱桿線蟲,鄰苯二甲酸二丁酯,壽命,生殖毒性,神經毒性

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是一種重要的鄰苯二甲酸酯類化合物(酞酸酯,PAEs),是工業上常用的增塑劑和軟化劑,多用于輪胎、橡膠、粘合劑、電線外皮等的生產[1-2],以增加其柔韌性、曲撓性和伸長性[3]。PAEs是一種環境內分泌干擾物,含雌性激素成分,能夠干擾人體正常的內分泌從而影響生殖系統,具有明顯的生殖、發育毒性[4]。由于在產品的生產加工過程中,DBP與高分子聚合物之間不以共價鍵形式結合,而是物理結合,長時間暴露在外,DBP可由塑料轉移到外界,對空氣、土壤、水等資源造成嚴重的污染[5-6],進而經口、呼吸、皮膚接觸、醫療暴露等途徑進入人體,通過生物富集作用,對生殖系統、內分泌系統、神經系統等均存在毒性效應[7-8]。已有研究證實,DBP對人類產生生殖毒性,造成男性不育和發育紊亂如尿道下裂、隱睪病、精子形成功能紊亂、肛門和生殖器之間距離縮短等[9-11]。小鼠實驗也表明,DBP誘發睪丸萎縮,可能原因是精母細胞死亡[12-13]。秀麗隱桿線蟲包含302個神經元,并且神經通路明確,因此線蟲是研究毒理學的良好模型[14-15],因此本實驗選擇秀麗隱桿線蟲為動物模型,研究DBP對線蟲的壽命、生殖毒性和神經毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌OP50與N2野生型C.elegans中國科學院生物物理研究所惠贈;鄰苯二甲酸二丁酯(DBP，純度:98.0%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

XDS-1B型倒置顯微鏡 重慶重光實業有限公司;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司;MJ-250F-II型霉菌生化培養箱 上海一恒科技有限公司;5804R型高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品板制備 分別吸取0.03125、0.125、0.5 mL的鄰苯二甲酸二丁酯于離心管中,分別加入二甲基亞砜(DMSO)溶解并定容至10 mL,再依次從中取出0.1 mL樣品溶液于新的離心管中,加入滅菌融化的NGM培養基并定容至10 mL,配制成濃度為32.5、131、522 mg/L的樣品溶液。另外,取0.1 mL DMSO加入到10 mL滅菌融化的NGM培養基中,制成溶劑對照組,再取10 mL滅菌融化的NGM培養基做純白對照組,無菌操作,將培養基倒入培養皿中,室溫冷卻。

在以上制備NGM培養基中涂布100 μL OP50菌液,20 ℃恒溫培養48 h,待大腸桿菌長出薄薄一層即可。

1.2.2 線蟲的前期處理 取含有成蟲期蟲較多的培養皿3板,同步化處理[16],將同步化培養后L2期蟲子切塊,分別接種到制備好的含樣品和空白的培養皿上,每個濃度各接3板。20 min后,觀察培養皿上蟲子的數量,確保在一百條左右。20 ℃恒溫培養24 h。

1.2.4 線蟲生殖能力分析實驗 從生理水平上,秀麗隱桿線蟲的產卵數反映的就是其生殖能力,根據線蟲產卵數便可分析出樣品鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗線蟲生殖能力的影響。結合秀麗線蟲壽命分析實驗,對照組和樣品組各挑取狀態相當的秀麗隱桿線蟲10條左右至鋪有大腸桿菌OP50的NGM培養基中,對照組和樣品實驗組分別作兩個平行。于20 ℃培養,每隔24 h將存活的秀麗線蟲挑至相同濃度的新的NGM培養基上,產卵數要在線蟲產卵后的第2 d記錄,即前一天的平板于20 ℃培養箱中經24 h培養后,便可記錄新繁殖出的秀麗線蟲的幼蟲數量。應準確記錄每次換下的舊板上幼蟲數量直至線蟲產卵完全結束喪失生殖能力。每條秀麗線蟲在產卵期產卵的總和即為秀麗線蟲的產卵數。實驗結果用SPSS Statistic 20.0軟件單因素方差分析。

1.2.5 線蟲移動能力測定實驗 正常線蟲的運動軌跡為正弦曲線,非正弦曲線運動軌跡反映運動平衡失調。本實驗中,隨機抽取一定數量的線蟲,測定其移動距離來反映樣品鄰苯二甲酸二丁酯對線蟲移動能力的影響。

利用壽命分析實驗中的樣品板和對照板進行移動能力實驗,每隔5 d從對照組和不同濃度樣品組中選取約10條秀麗線蟲,并且平行組也需進行測定。在高清晰度體式顯微鏡下觀察并記錄在1 min內線蟲移動時身體彎曲的數目。1次彎曲為線蟲相對于身體長軸方向上的一個波長的移動。平均移動距離是指每組平板中秀麗線蟲1 min內移動時身體彎曲的數目,以個為單位。實驗結果用Origin 9.1軟件進行統計處理。

1.2.6 線蟲吞咽頻率測定實驗 吞咽頻率可以成為一種評價秀麗隱桿線蟲攝食行為的指標。正常線蟲吞咽食物的頻率為200次/min。本實驗中,隨機抽取一定數量的秀麗線蟲測定其吞咽頻率來反映樣品鄰苯二甲酸二丁酯對其神經系統的影響。

利用壽命分析實驗中的樣品板和對照板進行吞咽頻率測定,每隔5 d從對照組和樣品組中選取約10條秀麗線蟲。在倒置攝像顯微鏡下觀察并記錄在1 min內秀麗線蟲的吞咽頻率。1次吞咽定義為咽泵從一側到另一側后,再返回來。實驗結果用Origin 9.1軟件進行統計處理。

1.2.7 數據處理 用SPSS 20.0處理數據,用OriginPro 9.1作圖。

2 結果與分析

2.1 線蟲壽命測定

如圖1所示,空白對照組秀麗線蟲的最長壽命為24 d;32.5 mg/L樣品實驗組線蟲最長壽命為22 d;131 mg/L樣品實驗組線蟲最長壽命為21 d;而當樣品濃度為522 mg/L時,線蟲壽命最短,僅為20 d。由此可知,隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的升高,線蟲生存時間逐漸縮短,反映了鄰苯二甲酸二丁酯對線蟲造成一定毒性影響,縮短線蟲的壽命并伴有一定的濃度依賴性。

圖1 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of different concentrations of dibutyl phthalate on the life of Caenorhabditis elegans

2.2 線蟲生殖能力測定

累計產卵數反映了秀麗線蟲的繁殖能力,通過測定產卵數有利于研究鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗線蟲在生殖能力方面引起的毒性作用。如圖2所示,與DMSO對照組相比,131 mg/L DBP處理組線蟲產卵數顯著降低(p<0.05),522 mg/L DBP處理組線蟲產卵數極顯著降低(p<0.01),表明鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗線蟲存在生殖毒性作用,影響其生殖和產卵能力。

圖2 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對秀麗線蟲產卵數的影響Fig.2 Effect of dibutyl phthalate solution with different concentrations on the fecundity of Caenorhabditis elegans注:與DMSO對照組相比,* p<0.05,**p<0.01;圖3、圖4同。

2.3 線蟲移動能力測定

移動能力作為秀麗隱桿線蟲的運動行為,可以反映線蟲神經系統的基本功能。該實驗觀察天數為20 d,從實驗進行第1 d起每隔5 d進行一次結果記錄,經分析四次結果總體趨勢一致,圖3所示為實驗進行的第5 d結果。平均移動距離是指每組平板中秀麗線蟲1 min內移動時身體彎曲的數目,以個為單位。如圖3所示,與DMSO對照組相比,131 mg/L 和 522 mg/L DBP處理組線蟲移動距離極顯著降低(p<0.01),表明鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗線蟲造成毒性影響。

圖3 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對秀麗線蟲移動能力的影響Fig.3 Effect of dibutyl phthalate solution with different concentrations on Caenorhabditis elegans mobile ability

2.4 線蟲吞咽頻率測定

該實驗觀察天數為20 d,從實驗進行第1 d起每隔5 d進行一次結果記錄,經分析四次結果總體趨勢一致,圖4所示為實驗進行的第5 d結果。平均吞咽頻率是指每組平板中線蟲1 min咽泵吞咽頻率。如圖4所示,131 mg/L和522 mg/L DBP處理組線蟲吞咽頻率極顯著降低(p<0.01),表明鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗線蟲造成毒性影響。

圖4 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對秀麗線蟲吞咽頻率的影響Fig.4 Effect of dibutyl phthalate solution with different concentrations on Caenorhabditis elegans swallowing frequency

3 結論與討論

本研究中鄰苯二甲酸二丁酯暴露導致秀麗隱桿線蟲的壽命縮短,生殖能力下降,移動速度減慢,吞咽頻率降低,且存在劑量依賴關系,表明鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗隱桿線蟲的生殖,壽命,神經等產生一定的毒性作用。研究資料表明,DBP對斑馬魚和果蠅的生殖與壽命也有一定的毒性影響。與秀麗隱桿線蟲相似,斑馬魚也是一種雌雄同體的魚類。DBP暴露降低斑馬魚的孵化率和受精率,提高子一代的死亡率[17-18]。其中,死亡率看做壽命指標,孵化率,受精率可等同于生殖能力。與本實驗相比較來看,得出的結論基本一致,即DBP有一定的生殖毒性,隨著濃度升高壽命逐漸縮短,生殖能力逐漸下降。不同的是,本次實驗主要觀察的是DBP對線蟲本身的毒性作用,沒有考慮對后代的影響。低濃度的DBP增強雌性果蠅的生殖能力,高濃度的DBP降低雌性果蠅的生育能力[19-20]。此結果與本次實驗的結果雖有差異,但也有吻合之處。本次實驗也證實在高濃度也就是DBP濃度為522 mg/L時,對線蟲的壽命和生殖的影響最明顯。然而在DBP為131 mg/L等低濃度時,對線蟲也有一定的生殖障礙和減緩壽命的作用,與以果蠅為模式動物的結果相反,這可能是由于DBP對兩種模式動物的作用機制不盡相同而造成,要待進一步實驗的論證。總之,無論是秀麗隱桿線蟲,斑馬魚或者果蠅,DBP都對其生殖能力和壽命有一定的影響。

[1]Schettler T. Human exposure to phthalates via consumer products[J]. Int J Androl,2006,29:134-139.

[2]Wormuth M,Scheringer M,Vollenweider M,et al. What are the sources of exposure to eight frequently used phthalic acid esters in Europeans[J].Risk Anal,2006,26:803-824.

[3]陳波.鄰苯二甲酸酯的毒理學效應及對人體健康的影響[J].化工技術與開發,2010,39(11):46-49.

[4]劉慧杰.鄰苯二甲酸二丁酯生殖發育毒性研究進展[J].環境與健康雜志,2004,21(2):122-124.

[5]郭永梅.鄰苯二甲酸酯的毒性及相關限制法規[J].廣州化學,2012,37(2):75-79.

[6]Blount BC,Silva MJ,Caudill SP,et al. Levels of seven urinary phthalate metabolites in a human reference population[J].EnvironHealth Perspect,2000,108(10):979-982.

[7]李蕾.鄰苯二甲酸二丁酯對巨噬細胞吞噬能力的影響研究[J].中國免疫學雜志,2011,27(9):771-774.

[8]陳洪濤.鄰苯二甲酸酯毒理學研究進展[J].Food & Machinery,2012,28(5):251-253.

[9]Jurewicz J,Radwan M. Human urinary phthalate metabolites level and main semen parameters,sperm chromatin structure,sperm aneuploidy and reproductive hormones[J]. Reprod Toxicol,2013,42:232-241.

[10]Tseng IL,Yang YF,Yu CW,et al. Phthalates induce neurotoxicity affecting locomotor and thermotactic behaviors and AFD neurons through oxidative stress in Caenorhabditis elegans[J].PLoS One,2013,8:e82657.

[11]Pant N,Shukla M. Correlation of phthalate exposures with semen quality[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2008，231(1):112-116.

[12]Yolton K,Xu Y,Strauss D,et al. Prenatal exposure to bisphenol A and phthalates and infant neurobehavior[J]. Neurotoxicol Teratol,2011,33:558-566.

[13]Alam MS,Ohsako S,Matsuwaki T,et al.Induction of spermatogenic cell apoptosis in prepubertal rat testes irrespective of testicular steroidogenesis:a possible estrogenic effect of dibutyl phthalate[J].Reproduction,2010,139(2):427-437.

[14]Leung MCK,Williams PL,Benedetto AAC,et al. Caenorhabditis elegans:an emerging model in biomedical and environmental toxicology[J]. Toxicol Sci,2008,106(1):17-19.

[15]魏巍.以秀麗線蟲為模式生物評價蓖麻堿毒性的研究[J].氨基酸和生物資源,2012,34(1):54-56.

[16]趙晴.秀麗隱桿線蟲研究綜述[J].安徽農業科學,2010,38(19):10092-10093.

[17]林玲.鄰苯二甲酸二丁酯對斑馬魚胚胎發育毒性的研究[J].衛生研究,2008,37(3):278-280.

[18]Min A,Liu F,Yang X,et al. Benzyl butyl phthalate exposure impairs learning and memory and attenuates neurotransmission and CREB phosphorylation in mice[J].Food Chem Toxicol,2014,71:81-89.

[19]張欣文.鄰苯二甲酸二丁酯對雄性果蠅生殖能力影響及其遺傳毒性[J].第四軍醫大學學報,2009,30(1):62-65.

[20]張欣文.鄰苯二甲酸二丁酯對雌性果蠅生殖能力的雙重作用[J].生殖與避孕,2008,28(6):329-333.

Study on the effects of dibutyl phthalate on physiological activity inCaenorhabditiselegans

LI Ping,MI Sheng-quan*,FENG Ya-fang,FENG Si-wen,ZHAO Zhuo

(College of Applied Arts and Science of Beijing Union University,Beijing 100191,China)

Objective:To study the influence of DBP on lifespan,reproductive toxicity and neurotoxicity inCaenorhabditiselegans. Methods:L2C.eleganswere expoused to the DBP concentration of 32.5,131,522 mg/L. Then nematode longevity,reproductive capacity,mobility and frequency of swallowing were measured. Results:The life span was shorten,reproductive,frequency of swallowing and mobile ability were reduced inCaenorhabditiselegansdue to DBP expose in a concentration-dependent manner. Conclusion:DBP induce reproductive toxicity and neurotoxicity inCaenorhabditiselegans,at the same time,it can shorten the lifespan ofC.elegans.

Caenorhabditiselegans;dibutyl phthalate;life span;reproductive toxicity;neurotoxicity

2016-09-26

李萍(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向: 營養與慢性病，E-mail:1114176776@qq.com。

*通訊作者:米生權(1975-), 男，博士，副教授, 研究方向: 營養與慢性病,E-mail:msq65@buu.edu.cn。

北京市教委研究項目資助(SQKM201311417014)；北京市屬高等學校人才強教計劃資助項目(PHR201107150)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.016