菊芋葉中多酚類成分的提取分離及結構鑒定

袁曉艷,封冬梅,陳曉蘭

(遵義醫學院 藥學院 分析化學教研室,貴州 遵義 563099)

菊芋葉中多酚類成分的提取分離及結構鑒定

袁曉艷,封冬梅,陳曉蘭

(遵義醫學院 藥學院 分析化學教研室,貴州 遵義 563099)

采用不同極性溶劑提取了菊芋葉中的多酚類成分，經正、反相色譜結合的方法分離純化了這些成分，并根據UV、MS和NMR數據鑒定了它們的化學結構。從菊芋葉中分離并鑒定的7個多酚化合物分別為咖啡酸(1)、3,5-二咖啡酰奎尼酸(2)、1,5-二咖啡酰奎尼酸(3)、4,5-二咖啡酰奎尼酸(4)、3,5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(5)、5,8-diOH-6,7,4'-triOMe(pedunculin) (6)、5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone(7),其中化合物1～5為酚酸類化合物,化合物6～7為黃酮類化合物。僅通過1H-NMR即可確定4個二咖啡酰奎尼酸化合物中2個咖啡酰基的取代位置。

菊芋葉;酚酸;黃酮;分離;結構鑒定

菊芋(HelianthustuberosusL.)原產于北美洲,俗稱洋姜、鬼子姜,為菊科(Compositae)向日葵屬(HelianthusL.)多年生草本植物。傳統上,菊芋被當作食物或者動物飼料。在過去的2個世紀里,人們發現菊芋塊莖富含菊糖,是自然界已知含有菊糖的36000種植物中菊糖含量最高的植物之一,開始開發利用菊芋中的菊粉、低聚果糖和果糖等作為功能性食品的添加劑[1-2]。菊芋地上部分主要含有酚酸、黃酮及倍半萜內酯類化合物,具有抗氧化、殺蟲抑菌、抑制腫瘤細胞生長等活性[3-9]，但對其研究開發較少。筆者曾利用高效液相色譜電噴霧電離質譜聯用技術,初步鑒定出菊芋葉中7個綠原酸類化合物，并測定了菊芋葉中含量最大的成分綠原酸的含量[3,10]。本實驗通過進一步分離純化研究,從菊芋葉中分離得到7個多酚類化合物,并對其結構進行了鑒定。

1 儀器、試劑及材料

Bruker Avance-500核磁共振儀； Thermo Finnigan TSQ質譜儀,電噴霧離子源(ESI)； Waters DP-4000制備液相色譜, Waters Prep Nova-Pak C18徑向加壓柱(300 mm ×20 mm,6 μm)； Waters 2690高效液相色譜儀,配996型二極管陣列檢測器。聚酰胺樹脂(30～60目)，為浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠生產; H60型薄層層析硅膠(200～300目)，為青島海洋化工廠生產;石油醚(分析純,科密歐);乙酸乙酯(分析純,科密歐);甲醇(色譜純,山東禹王); Millipore超純水。

實驗所用菊芋葉于2010年11月采摘于陜西榆林地區,由南京農業大學資源與環境學院劉兆普教授鑒定為菊科向日葵屬菊芋的干燥葉子。

2 提取和分離

2.1 酚酸類化合物的提取分離

將干燥菊芋葉1 kg粉碎后,以20倍量(v/m)60%乙醇回流提取2次；合并提取液，減壓濃縮得浸膏248 g,浸膏得率為24.8%。取200 g浸膏用熱水溶解,對懸浮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次后濃縮至浸膏狀,分別得到石油醚萃取物6.4 g、乙酸乙酯萃取物53.0 g、正丁醇萃取物41.0 g,水部位重105.0 g。其中乙酸乙酯萃取部位過聚酰胺樹脂，以乙醇-水梯度洗脫[10∶(90～100)∶0]，得6個部位P1～P6；經高效液相色譜分析后,合并P3、P4部位,以反相制備液相色譜在洗脫劑甲醇-0.5%乙酸水(36∶64)等度洗脫條件下得到化合物1(80.20 mg)、2(48.60 mg)、3(500.00 mg)、4(35.00 mg)、5(20.00 mg)。

2.2 黃酮類化合物的提取分離

稱取菊芋葉6 kg,以乙酸乙酯浸泡提取,每次浸泡24 h,提取3次,過濾后合并提取液,減壓濃縮至浸膏狀,浸膏以甲醇溶解,過濾除去甲醇不溶物,得到菊芋總提取物浸膏170 g。將浸膏過200～300目硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫[90∶(10～20)∶80],收集石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)、石油醚∶乙酸乙酯(8∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)、石油醚∶乙酸乙酯(4∶6)、石油醚∶乙酸乙酯(2∶8)洗脫液,分別命名為F1～ F5；F3部位過H60型薄層層析硅膠裝填中壓制備柱進行進一步分離,用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(90∶10、80∶20、70∶30、60∶40),最后以甲醇沖洗色譜柱,得P1～P6六個洗脫部位。P3部位得黃色針狀晶體,過濾得化合物6(236.00 mg); P4部位放置后有淡黃色晶體沉淀,過濾,得化合物7(148.00 mg)。

3 結構鑒定

3.1 化合物1的結構鑒定

化合物1為淡黃色粉末,易溶于熱水及甲醇, mp 208～210 ℃,UV(MeOH-H2O):239.4,323.2 nm。1H-NMR(DMSO-d6,500 MHz):7.42 (1H,d,J=5.8 Hz,H-7),7.03 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.96(1H, dd, J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.76(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.17(1H,d,J=15.8 Hz,H-8)。13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz):168.4 (C-9),148.1(C-4),145.5(C-7),144.5(C-3),125.7(C-1),121.1(C-8),115.73(C-2),115.12(C-5),114.61(C-6)。以上數據與文獻[11]基本一致,故確定化合物1為咖啡酸。

3.2 化合物6的結構鑒定

化合物6為黃色針狀晶體,易溶于氯仿,三氯化鐵顯色陽性。ESI-MS:344(M+),329,314,299,依次失去3個甲基。1H-NMR(CDCl3, 300 MHz)δ:12.75(1H,s,C5-OH),7.89(2H,dd,J=2,6.8 Hz,H-2′,6′), 7.04(2H,dd,J=2.72 Hz, H-3′,4′),6.59(1H,s,H-3),3.901～4.021(3H each,s,OMe×3)。C-NMR(CDCl3,300 Hz)δ:183.2(C-4),164.0(C-2),162.9(C-4′),149.0(C-7),148.6(C-9),146.0(C-5),130.9(C-6),130.1(C-2′,C-6′),127.6(C-1′),115.7(C-3′,C-4′),104.8(C-10)103.9(C-3),62.03(-OCH3),61.2(-OCH3),55.8(-OCH3)。以上數據與文獻[12]基本一致,鑒定化合物6為5,8-diOH-6,7,4′-triOMe(pedunculin)。

3.3 化合物7的結構鑒定

化合物7為黃色粉末(氯仿)，mp:190～192 ℃,ESI-MS:374(M+),359,344,329,314,依次失去4個甲基。1H-NMR(CDCl3,300 MHz)δ:7.60(1H,dd,J=2.1,8.4 Hz,H-6′),7.42(1H,d,J=1.8 Hz,H-5′),7.01(1H,d,J=8.7 Hz,H-2′),6.76(1H,s,H-3),3.98～4.05(3H each,s,OMe×4)。C-NMR(CDCl3,300 Hz) δ:182.3(C-4),162.9(C-2),152.1(C-3′),150.9(C-4′),149.0(C-9),148.3(C-7),145.4(C-6),131.5(C-5),127.9(C-8),122.9(C-1′),119.7(C-6′),111.7(C-5′),109.1(C-2′),103.3(C-10),102.9(C-3),61.1(-OCH3),60.1(-OCH3),55.7(-OCH3×2)。以上核磁數據與文獻[13]報道數據基本一致,鑒定化合物7為5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone。

3.4 化合物2～5的結構鑒定

化合物2～5在242 nm和327 nm附近有最大紫外吸收,一級質譜負離子全掃描結果表明化合物2～4的m/z均為514.9,化合物5的m/z為529。負離子模式下二級質譜掃描結果顯示,化合物2～5均存在191、179、173、161四個特征離子碎片,應為[quinic acid-H]-、[caffeic acid-H]-、[quinic acid- H2O -H]-和[caffeic acid-H2O-H]-。由此可以確定化合物2～5為二咖啡酰奎尼酸類化合物。單從一級二級質譜難以確定咖啡酰基在奎尼酸上的取代位置,必須輔以NMR數據進行確證。由于咖啡酰基取代位置的不同可以引起奎尼酸上H發生相應的特征化學位移改變,僅以1H-NMR數據即可確定咖啡酰基的取代位置,從而確定二咖啡酰奎尼酸類化合物的結構。

在奎尼酸中,3、4、5位氫的化學位移值分別為δ4.09、δ3.39、δ3.99。4-H處于直立鍵位置,它與處于直立鍵位置的5-H之間的二面角為180°,偶合常數較大(J=7.3 Hz),而它與處于平伏鍵位置的3-H之間的二面角為60°,偶合常數較小(J=2.6 Hz),因此,4-H在1H-NMR譜中表現為dd峰。5-H處于直立鍵位置,與6-H(a)也有較大的偶合常數,而與6-H(e)偶合常數較小,因此,5-H表現為寬的多重峰。3-H處于平伏鍵位置,與4-H以及2-H(a,e)之間的二面角均為60°,偶合常數較小,所以與5-H相比,3-H分裂為較窄的多重峰。當奎尼酸上的羥基氫被咖啡酰基取代后,同碳上的氫由于咖啡酰基的吸電子作用,化學位移會向低場大幅度移動,化學位移δ值大于5,而羥基氫未被取代的碳上氫的δ移動幅度較小,化學位移δ值小于5[14]。

在化合物2中,較窄多重峰3-H和較寬多重峰5-H的化學位移分別移向低場δ 5.39和5.43處,而dd峰的4-H的化學位移移至δ 3.96,化學位移改變較小;另外化合物2的1H-NMR數據與文獻[13]的結果一致,由此判斷化合物2為3,5-二咖啡酰基奎尼酸(3,5-DiCQA)。在化合物3中,較寬的多重峰5-H的化學位移移至5.24,3-H及4-H的化學位移分別移至4.08、3.62,改變較小,所以另1個咖啡酰基的取代位置只能發生在奎尼酸1位羥基上,與文獻[15]報道的1H-NMR的數據基本一致,確定化合物3為1,5-二咖啡酰基奎尼酸(1,5-DiCQA)。化合物4較寬的多重峰5-H以及dd四重峰的化學位移分別移至5.62、5.12,較窄的多重峰3-H的化學位移為4.38,改變較小,與文獻[16]報道的數據一致,確定化合物4為4,5-二咖啡酰奎尼酸(4,5-DiCQA)。在化合物5中,3,4,5-H的化學位移改變趨勢與化合物2一致,咖啡酰基的取代位移相同,與化合物3比較,化合物5另有一甲氧基的H譜信號,且在同一色譜條件下化合物5在反相色譜柱上的保留時間遠遠長于化合物2的,分別為35.56、16.38 min,甲氧基的取代大大降低了化合物的極性,由此確定化合物甲氧基取代發生在奎尼酸的羧基位置,化合物5的1H-NMR數據與文獻[15]報道的數據一致,確定化合物5為3,5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(3,5-DiCQAME)。化合物2～5的結構式見圖1,各自的1H-NMR數據見表1。

圖1 菊芋中二咖啡酰奎尼酸類化合物的結構

4 小結與討論

本實驗研究了菊芋葉中的多酚類化學成分,通過多重色譜結合的方法從菊芋葉中分離制備了7個多酚類化合物,并采用UV、MS結合NMR鑒定了分離所得化合物的結構,分別為咖啡酸(化合物1)、3,5-二咖啡酰奎尼酸(2)、1,5-二咖啡酰奎尼酸(3)、4,5-二咖啡酰奎尼酸(4)、3,5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(5)、5,8-diOH-6,7,4'-triOMe(pedunculin) (6)、5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone(7),其中化合物1～5為酚酸類化合物,化合物6～7為黃酮類化合物,化合物2～7均為首次從菊芋葉中分離獲得。另外，對4個二咖啡酰奎尼酸化合物2～5的1H-NMR數據進行了分析，得出了該類化合物咖啡酰基取代位置不同時的特征化學位移。

多酚類化合物具有抗氧化、強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力、抗輻射等功能,對癌癥、糖尿病及心血管疾病等慢性病具有良好的預防作用,因此研究開發多酚類化合物有著廣闊的市場前景及重要的現實意義。菊芋葉中多酚類化合物的研究為菊芋成為新的生物資源提供了依據。

表1 4個二咖啡酰奎尼酸類化合物的1H-NMR數據

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(責任編輯:黃榮華)

Extraction, Separation and Structural Identification of PolyphenolicComponents from Leaves ofHelianthustuberosus

YUAN Xiao-yan, FENG Dong-mei, CHEN Xiao-lan

(Department of Analytical Chemistry, School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China)

The polyphenolic components were extracted from the leaves ofHelianthustuberosusthrough adopting different polarities of solvents, these components were separated and purified by using the normal-phase and reversed-phase chromatographic techniques, and their chemical structures were identified by UV, MS and NMR spectral data analysis. Seven polyphenolic compounds were separated from the leaves ofH.tuberosus, and they were identified as caffic acid (1), 3,5-dicaffeoylquinic acid (2), 1,5-dicaffeoylquinic acid (3), 4,5-dicaffeoylquinic acid (4), 3,5-dicaffeoylquinic acidic methyl ether (5), 5,8-diOH-6,7,4′-triOMe (pedunculin) (6), and 5,8-diOH-6,7-diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone (7). Among them, the compounds 1～5 were attributed to phenolic acids, and the compounds 6～7 were flavonoids. Meanwhile, the replacement places of 2 caffeoyls in 4 dicaffeoylquinic acid compounds could be determined only by1H-NMR data analysis.

Helianthustuberosusleaf; Phenolic acid; Flavonoids; Separation; Structural identification

2016-11-07

遵義醫學院博士啟動基金資助項目(F-635);貴州省聯合基金資助項目(CK-881)。

袁曉艷(1980─),女,山東臨沂人,副教授,博士,主要從事藥用植物成分研究工作。

R284

A

1001-8581(2017)04-0081-04