椰子SSR-PCR反應體系的優化

周麗霞

(中國熱帶農業科學院 椰子研究所/海南省熱帶油料作物生物學重點實驗室，海南 文昌 571339)

椰子SSR-PCR反應體系的優化

周麗霞

(中國熱帶農業科學院 椰子研究所/海南省熱帶油料作物生物學重點實驗室，海南 文昌 571339)

為進一步開發利用椰子種質資源和開展分子標記輔助幼苗早期篩選及遺傳育種工作，采用L9(34)正交試驗設計，探索了椰子SSR-PCR的最佳反應體系。通過對模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、退火溫度的篩選優化，建立了椰子SSR-PCR最佳反應體系(10 μL)為：模板DNA 60 ng、Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 250 μmol/L、Taq酶0.5 μmol、引物0.5 μmol/L、退火溫度58 ℃，在該體系條件下，PCR擴增條帶最為清晰，該反應體系的優化，為今后應用SSR標記技術為椰子群體結構分析、種質資源豐富度、基因定位和遺傳育種等研究奠定工作基礎。

椰子；正交設計；SSR-PCR；體系優化

椰子在我國海南、廣東等熱帶地區都有一定規模的種植，其不僅是熱帶地區園林綠化的主要植物，也是典型的木本油料作物和食品能源作物，具有重要的社會經濟價值[1-2]。據調查統計，我國椰子的種質資源相對豐富，為優良品種的選育奠定了遺傳基礎。常規的育種方法非常耗時，周期較長，隨著高通量測序技術的發展，分子標記的開發和應用已越來越成熟，諸多研究小組已將該技術應用到分子輔助育種工作中，如：油茶、藥用菊花和水稻等[3-5]。此外，通過對目標性狀緊密連鎖基因進行標記，可方便、準確和快捷地對早期幼苗進行篩選，這不僅縮短了大量的選擇時間，還節約了勞動力成本和土地等資源。

常用的分子標記技術有RAPD、RFLP、AFLP、ISSR和SSR等。其中，SSR又稱微衛星，是一段為1～5個核苷酸重復單元的簡單串聯重復序列。SSR普遍存在于動植物基因組中，主要根據特異性引物的PCR擴增，經聚丙烯酰胺垂直電泳并銀染顯色，來判斷物種的多態性[6-7]。相對其他幾種分子標記技術，SSR分子標記具有明顯的優勢：呈共顯性、所需DNA樣本量較少、重復性好等，因此，SSR分子標記技術是植物遺傳研究領域中重要的手段之一。

目前，我國應用SSR分子標記技術對椰子種質資源、分子育種方面的研究相對有限，摸索SSR反應體系中各種因素的最佳條件，對SSR-PCR反應體系進行最優化，對SSR分子標記的挖掘十分關鍵，因此，本研究采用L9(34)正交設計試驗[8]，通過對SSR-PCR反應體系各種因素進行篩選和優化來建立SSR-PCR反應最佳體系，同時利用該體系完成多態性SSR引物的篩選工作。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本地高種椰子材料均來自中國熱帶農業科學院椰子資源圃，取椰子嫩葉作為試驗樣本，完成DNA提取工作。

SSR-PCR反應中的Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR buffer、DNA提取所需試劑、瓊脂糖電泳所需試劑均訂購于海南省合輝實業有限公司，2000 bp Marker訂購于天根生化科技有限公司。

根據Illumina高通量測序獲得的椰子轉錄組數據，應用Primer 5軟件設計SSR引物，SSR引物由深圳華大科技有限公司合成，引物1：Forward：5′-GGGAATAACAAAGCAGCAAAAC-3′，Reverse：5′-CCCCTACTAATGTCCACCAGAA-3′。

1.2 DNA提取

椰子基因組DNA提取采用CATB法，稍有改進[9]。稱取0.3 g椰子葉片樣本，液氮磨碎，轉入2 mL離心管中，加入600～700 μL CTAB提取液，65 ℃水浴保溫45～60 min后取出離心管，使其自然降至室溫，加入500 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下顛倒混勻后，靜置10 min，10000 r/min離心8 min，吸取上清液，加入等體積(600 μL)冰凍的無水乙醇靜置5 min，用槍頭挑出DNA，用75%乙醇浸泡過夜，挑出DNA至1.5 mL離心管中使其干燥后，加入100 μL ddH2O溶解，-80 ℃保存。

1.3 PCR擴增反應和電泳檢測

PCR反應擴增程序為：94 ℃預變性5 min，35個循環(94 ℃變性30 s，退火溫度復性30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸7 min，22 ℃保存。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測：取4 μL PCR擴增產物和2 μL 6×Loading Buffer混勻，點入含有1 mg/L溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠中，用1×TAE buffer在恒壓120 V下電泳約40 min，最后用紫外凝膠成像系統成像。

1.4 PCR反應體系的正交試驗設計

應用L9(34)正交試驗設計，首先對dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶和引物濃度進行優化，設計方案見表1和表2，找出最優組合后，再對DNA的用量進行優化，試驗各組合均為10 μL反應體系。

1.5 退火溫度(Tm)篩選

根據引物的理論Tm設計4個梯度溫度，分別為：54、58、62、66 ℃，隨機選取編號為714、1687、740和753的椰子樣本進行SSR-PCR擴增，確定最佳退火溫度。

表1 SSR-PCR體系的因素

表2 SSR-PCR正交試驗設計方案

1.6 體系穩定性檢測

隨機選取5對SSR引物，選用黃矮椰子品種的DNA對優化后的SSR-PCR體系及參數進行可靠性和穩定性考察，每對引物重復2次。

2 結果與分析

2.1 SSR-PCR反應體系的L9(34)正交優化

由圖1可知，L9(34)正交設計9個組合的SSR-PCR反應體系擴增結果，4個影響因素不同濃度的組合使得擴增結果存在明顯差異。第1、7和8組擴增條帶明亮，條帶大小與理論值相符，但出現了明顯的引物二聚體，第2、3和4組條帶亮度相對較弱，第5和6組擴增結果有輕微不穩定性，每組的亮度不一致，重復性不太理想。第9組擴增的條帶明亮、清晰，切條帶大小與理論值相符，重復性較好，亮度一致，無引物二聚體。

根據對各組合擴增結果的比較分析，第9組的各種因素組合為最佳選擇，即10 μL反應體系中含2.5 mmol/L Mg2+、250 μmol/L dNTP、0.5 μmol Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物。

2.2 模板DNA濃度對SSR-PCR擴增結果的影響

在最佳組合條件下，為進一步考察樣本DNA的用量，本試驗分別選用30、40、50、60、70 ng/10 μL。由圖2可知，DNA用量為30、40和50 ng/10 μL時，條帶(1、2和3組)亮度較差，DNA用量為60和70 ng/10 μL時，條帶(4和5)結果明亮清晰，擴增特異性較好，無條帶彌散和引物二聚體出現，從節約DNA樣本的角度考慮，筆者選用60 ng/10 μL為該體系的DNA模板的最佳濃度水平。

M：marker，1～9：組合編號，每個組合重復2次

圖2 不同濃度模板DNA的SSR-PCR擴增結果

2.3 退火溫度對SSR-PCR擴增結果的影響

退火溫度在一定程度上決定了引物與模板的特

異性結合，從而影響了擴增結果。由圖3可知，在58 ℃時擴增出的條帶清晰明亮，而在54、62 ℃條件下，條帶亮度較弱，66 ℃條件下無條帶出現。因此，該體系的最佳退火溫度為58 ℃。

2.4 SSR-PCR體系的穩定性考察

隨機選取5對SSR引物，選用黃矮椰子品種的DNA對優化后的椰子SSR-PCR體系及參數進行可靠性和穩定性考察，每對引物重復2次。結果表明：5對引物的擴增結果均清晰明亮，特異性強，無彌散條帶和引物二聚體的出現，每對引物的重復性均較好，該結果表明椰子SSR-PCR體系參數具有較好的可靠性和穩定性(圖4)。

圖3 不同退火溫度的SSR-PCR擴增結果

圖4 SSR-PCR體系的穩定性結果

3 討論

在常用的分子標記技術(RAPD、RFLP、AFLP、ISSR、SSR)中，SSR分子標記具有顯著的優勢：呈共顯性、重復性好、對樣本DNA的純度要求不高等，因此，SSR分子標記技術是植物遺傳研究領域中重要的手段之一。

椰子作為我國海南地區的主要木本油料作物和食品能源作物之一，栽培歷史悠久，其經過長期的自然選擇和人工選擇，已形成多個品種，為優良品種的選育奠定了遺傳基礎。諸多研究小組已將分子標記技術應用到分子輔助育種工作中，如油茶、藥用菊花和水稻等，但應用SSR分子標記技術對椰子種質資源、分子育種方面的研究相對有限。

探索PCR反應體系中各種因素的最佳條件，對SSR-PCR反應體系進行最優化，對SSR分子標記的挖掘十分關鍵。本研究對椰子SSR-PCR反應體系中的dNTP、引物、Mg2+、Taq酶、退火溫度、模板DNA等因素進行優化，通過L9(34)正交試驗，發現不同的組合對擴增結果的影響較大。其中，Taq酶用量過大不僅造成試劑的浪費，而且會帶來引物二聚體。而Mg2+作為Taq酶的輔酶，其濃度的高低會影響Taq酶的活性，濃度較低時會使得酶活性降低，而濃度過高后又會引起非特異性擴增。dNTP濃度的高低決定了擴增效率，但濃度過高時將會與Taq酶競爭Mg2+；退火溫度決定引物和模板的結合，溫度過低時會有非特異性擴增，過高時會造成無擴增條帶；引物的濃度過高時會造成引物二聚體的出現，過低時目標條帶會很弱。本試驗采用L9(34)正交試驗設計，使得各種影響因子充分組合，最終篩選出椰子SSR-PCR 10 μL反應體系為：模板DNA 60 ng、Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 250 μmol/L、Taq酶0.5 μmol、引物0.5 μmol/L、退火溫度58 ℃，在該體系條件下，PCR擴增條帶最清晰，穩定性和重復性良好，這為我國椰子群體結構、遺傳多樣性分析及幼苗早期篩選等研究工作奠定了扎實的工作基礎。

[1] 毛彧，傅國華.海南椰子種質資源研究綜述[J].安徽農業科學，2011，39(1)：439-442.

[2] Whitehead R A. Sample survey and collection of coconut germplasm in the Pacific islands (30 May-5 September 1964)[J]. London, UK: HMSO, Ministry of Overseas Development, 1966.

[3] 范小寧，林萍，張盛周.油茶SSR-PCR反應體系的優化研究[J].安徽農業科學,2011,39(23):14098-14102.

[4] 何仁鋒，馮尚國，陳喆.藥用菊花SSR-PCR反應體系優化及引物篩選[J].分子植物育種,2015,13(2):367-378.

[5] Salqotra R K, Gupta B B, Bhat J A. Genetic diversity and population structure of Basmati rice (OryzasativaL.) germplasm collected from North Western Himalayas using trait linked SSR markers[J]. Plos one, 2015, 10(7): e0131858.

[6] Qiu L J, Yang C Y, Tian B. Exploiting EST databases for the development and characterization of EST-SSR markers in castor bean (RicinuscommunisL.)[J]. BMC Plant Biology, 2010, 10(1): 1-10.

[7] 周靜，張錫九，陳其兵.分子標記在椰子種質資源和遺傳育種研究中的應用[J].四川林業科技,2007,28(6):39-43.

[8] 楊迪菲，秦智偉，王桂玲.黃瓜SSR-PCR反應體系的優化[J].東北農業大學學報,2006,37(5):619-623.

[8] Xiao Y, Zhou L X, Xia W, et al. Exploiting transcriptome data for the development and characterization of gene-based SSR markers related to cold tolerance in oil palm (Elaeisguineensis)[J]. BMC Plant Biology, 2014, 14(1): 384.

(責任編輯：曾小軍)

Optimization of SSR-PCR Reaction System for Coconut (Cocosnucifera)

ZHOU Li-xia

(Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science /Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Oil Crop Biology, Wenchang 571339, China)

In order to further utilize coconut (Cocosnucifera) germplasm resources and to develop marker-assisted seedling screening and genetic breeding, we explored the optimum SSR-PCR reaction system for coconut by adopting L9(34) orthogonal test design. Through the screening and optimization of template DNA, Mg2+, dNTPs, Taq enzyme, primer and annealing temperature, the optimized SSR-PCR reaction system (10 μL) for coconut was constructed as follows: template DNA 60 ng, Mg2+2.5 mmol/L, dNTP 250 μmol/L, Taq enzyme 0.5 μmol, primer 0.5 μmol/L, and annealing temperature 58 ℃. Under the conditions of this system, the bands of PCR amplification were the clearest. Thus, the results of this study laid the foundation for the researches and analysis of coconut group structure, germplasm resource abundance, gene mapping and genetic breeding through SSR marker technique.

Coconut; Orthogonal design; SSR-PCR; System optimization

2016-11-25

國家自然科學基金(31607123)。

周麗霞(1982─)，女，山東聊城人，助理研究員，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。

S667.4

A

1001-8581(2017)04-0036-04