不同孔徑的網罩對玉米花粉的影響

隆文杰，周國雁，雷涌濤，伍少云，蔡 青

(云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南 昆明 650223)

不同孔徑的網罩對玉米花粉的影響

隆文杰，周國雁*，雷涌濤，伍少云**，蔡 青**

(云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南 昆明 650223)

為探索玉米人工套袋授粉的替代方法，采用200、240和300目(分別相當于75、61、48 μm)的聚乙烯網罩，分別用于隔離云玉黑甜二號、養派四行玉米、小白糯、爆裂玉米、白糯玉米等試驗材料的異源花粉，通過比較去雄植株所結果穗的籽粒數、留雄植株花粉散落的距離、植株葉片和收獲籽粒間的SSR帶型差異，研究了不同網罩隔離玉米花粉的效果及其對花粉散落和群體遺傳結構的影響，結果表明：300目的網罩能阻擋85%以上的玉米花粉，隔離效果較好；但即使在不完全固定方式下，網罩依然對玉米花粉散落的空間產生了一定的限制和束縛作用；而在完全固定方式下，網罩使玉米群體的遺傳結構發生了明顯的改變。因此，網罩雖然能隔離玉米花粉，但還應研究固定它的合適方式和避免群體內個體發生自交的管理方式。

網罩；隔離；玉米；花粉

人工套袋和群體內姊妹混合授粉是玉米種質資源更新繁殖和自交系提純復壯、防止異源花粉滲入導致混雜、保證群體遺傳完整性和個體異質性的重要措施。因此，套袋授粉的質量決定了繁殖玉米籽粒的數量及純度。但是，套袋授粉的質量不僅受到操作者的技術水平、熟練程度的影響，而且還受到刮風、下雨等自然因素的嚴重影響。比如，前一天剛套好、準備用于第二天授粉的雄花袋，被雨淋濕、浸透，不但需要重新套袋，增加了工作量和人力成本，更延誤了為適齡雌穗花絲授粉的時機。現在雖然有防水性較牛皮紙袋更強且廣泛應用的硫酸紙袋或羊皮紙袋，但其防水能力仍然有限。玉米是異花風媒作物[1]，雌花套袋是為了防止群體外的異源花粉侵入，并使雌花授粉結籽而造成混雜，而群體內姊妹混合授粉是為了避免個體發生自交，導致群體的遺傳結構發生改變。因此，如果有一種方法或者措施，既能隔離異源花粉又能保證群體內個體間相互傳粉，避免自交，保障繁殖前后的群體具有最大的遺傳相似性，而且較傳統方法省工，對于玉米種質資源的更新繁育與保存研究具有重要意義。

玉米的雌花袋如縮小的“蚊帳”，是為防止雌穗花絲接受異源花粉而設計的隔離工具，雄花袋的作用是收集新鮮花粉。如果把雌花袋放大成大“蚊帳”，罩住繁殖的整個群體或小區，就能達到既隔離異源花粉，又省去雌穗套袋、采集雄穗花粉和雌穗花絲授粉的過程。事實上，用網罩隔離異源花粉的方法，在一些作物中早有報道。魏守恩等[2]在向日葵舌狀花即將展開時，用60目(250 μm)的網袋罩住花盤，用受體材料姊妹株的花粉為小花授粉，然后割掉授粉后的小花花柱，把供體材料的DNA提取液涂抹到種子鈍端花柱斷面，再為花盤重新套上網袋，培育出了比原品種含油率高約4%的新的不育株。馬緣生等[3-4]在紗網或網棚隔離下，研究了異花授粉作物大白菜、甜蕎麥、薏苡、常異花授粉作物多花菜豆的繁殖群體、授粉方式、收獲種子與原種子的同工酶，指出蕎麥在網罩內的適宜繁殖群體為50～100株，家蠅傳粉；大白菜宜采用50～100株，人工套袋鏈式雜交授粉，而不是網罩隔離混合授粉；多花菜豆宜采用50株以上，全封閉網棚，蜜蜂傳粉；薏苡也為風媒植物，稈高大，難封頂，在網罩隔離下生產的種子與原種在主要性狀上存在極大的差異，因而不宜采用網罩隔離方式繁殖。汪德鋒等[5]報道了孔徑75、48、38 μm的防蟲網隔離水稻花粉的效果，指出水稻花粉漂移頻率與風向、風速大小密切相關，下風口的花粉漂移頻率顯著高于上風口的漂移頻率，建議在生產水稻原種時宜采用孔徑48 μm的防蟲網阻擋異源花粉。賀永錄[6]報道：180目(80 μm)的網室可有效地隔離常異花授粉作物蠶豆的異源花粉。王甲璽[7]報道：隔離網室加蜜蜂輔助授粉，能有效提高甜蕎麥原原種的種子純度。

根據蘭盛銀等[8]的觀察，玉米花粉粒的直徑為80～85 μm；而林均安[9]認為玉米花粉粒的直徑為80～100 μm；陳敏[10]等則認為是70～90 μm。但是，目前還沒有利用網罩隔離玉米花粉的報道。所以，委托網袋加工企業制作了長5 m、寬1 m、高2.5 m，目數200、240、300目，分別相當于75、61、48 μm的3種規格聚乙烯網罩。試圖開展玉米人工套袋授粉替代方法的研究，探討利用網罩隔離玉米花粉的可行性，以及網罩對玉米花粉散落和群體遺傳結構可能造成的影響，以便在玉米種質資源更新繁殖過程中既能更好地保持繁殖對象的遺傳完整性，又能降低人為失誤，節約人工成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試玉米材料云玉黑甜二號，為云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所(本課題組)以芒市黑糯玉米和泰國白甜玉米，通過品種間雜交、自交，于2010年選育成的黑粒甜玉米。養派四行玉米為2015年本課題組在云南普洱市孟連縣勐馬鎮芒海村養派組收集到的糯玉米地方群體，據說在當地已有很悠久的種植和利用歷史。主要表現為糯性、口感好，皮薄、穗小、粒小、粒少，果穗多數4～8行，產量極低。小白糯、爆裂玉米和花包谷為云南省農業科學院作物種質資源中期庫保存的云南省瀘水縣、永平縣和寧蒗縣的地方品種，保存編號分別為230658-1442、231497-837和231752-1929。白糯玉米為丟失產地和保存編號等信息的地方品種。

1.2 田間試驗設計

試驗1：在面積約為6 m×75 m的優異資源云玉黑甜二號展示田中央，間隔選取3個小區，每區行長5 m、窄行40 cm、塘距40 cm、寬行1 m，包括48株玉米。在玉米植株臨近抽雄時，分別用200、240和300目的網罩，從植株頂部住下罩住整個小區的全部植株，并將網罩四角及兩面中部系于玉米植株根部，以防被風刮走，網罩多余的部分則隨意蓋在植株頂部，可隨風飄動，沒有被完全固定。然后，每2～3 d解開系繩，鉆入罩內，觀察并摘除露出劍葉鞘的雄穗。直到果穗成熟后，摘除網罩，收獲罩內植株所結的果穗，觀測并記錄果穗粒數，以罩外開放授粉的同品種、人工套袋授粉的其他品種的果穗籽粒為對照，判斷網罩隔離花粉的效果。

試驗2：在上述優異資源云玉黑甜二號，面積約為6 m×75 m的養派四行玉米展示田的中央，隨機選取未抽絲的雌穗10穗，分別用15 cm×10 cm×5 cm的200、240和300目的小網袋，將雌穗頂端套入袋內，再將網袋開口端固定在雌穗后的莖稈上。待網袋外的其他果穗成熟后，收獲袋內果穗，觀測并記錄果穗粒數，也用袋外開放授粉的同品種果穗、人工套袋授粉的其他品種的果穗籽粒為對照，判斷網袋隔離花粉的效果。

試驗3：試驗材料為花包谷。在行長5 m、窄行40 cm、塘距40 cm、寬行1 m的小區內，按第1穴播種2粒紫色種子，第2～4穴每穴播種2粒白色種子，第5穴播種2粒黃色種子，第6～8穴又每穴播種2粒白色種子，第9穴再播種2粒紫色種子的順序，共播種24穴48粒種子(圖1)。在玉米植株快抽雄時，用240目的網罩將整個小區的植株罩住，為防止網罩被風吹走，網罩也被不完全固定。隨后每2～3 d解開系繩，鉆入罩內，觀察并摘除由白色種子的植株抽出的雄穗，留下紫色和黃色種子的植株的雄穗。直到果穗成熟后，摘除網罩，分穴收獲罩內白色種子的植株所結的果穗，觀測并分別記錄每穴收獲果穗的籽粒顏色及數目，以在白色種子的植株上獲得的紫色和黃色籽粒占所在穴籽粒數的比率表示雄穗使周圍雌穗授精的授粉率，以紫、黃色種子所在穴至白色種子所在穴的距離表示雄穗花粉散落的距離，判斷網罩對玉米花粉散落的影響。

圖中數字表示穴號，紫和黃：表示該穴播種的種子顏色，剩余為播種白色種子的穴位

試驗4：將小白糯、爆裂玉米和白糯玉米種植成3×3個小區，每區行長5 m、窄行40 cm、穴距40 cm、寬行1 m，包括48株。在喇叭口時期，隨機采集每區20～30株的約半個葉片，保藏在-20 ℃冰柜中待用。然后，在小區四角將高30～50 cm的竹竿打入地里，再將長5 m和50 cm左右的竹竿各2根，橫架并捆扎在離地面50 cm左右的4根直立的竹竿上。抽雄時，用200、240和300目的網罩，由上至下分別套住每一個材料的各1個區，并將網罩由上自下拉緊并捆綁在已準備好的竹架上，使網罩和玉米植株都不能隨風搖動，即網罩被完全固定。成熟時，混合收獲罩內的果穗，待用。

1.3 DNA提取、SSR引物篩選與PCR擴增

將試驗4保藏留用的每區植株的葉片用液氮磨碎，置于-20 ℃保存備用。然后，將收獲的該試驗的每區每果穗3～5粒種子，在25～30 ℃的培養箱中萌發、生長7 d，剪取幼葉及芽，也用液氮磨碎，保存在-20 ℃的冰箱中待用。

用北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產的“新型植物基因組DNA快速提取試劑盒”，按照生產商的使用說明提取參試材料葉片和種子的DNA，用NY/T 1432─2014《玉米品種真實性鑒定SSR標準》推薦的40對引物和PCR反應程序，擴增3個參試材料的葉片混合DNA，5% PAGE凝膠電泳和銀染色法檢測擴增產物，篩選出條帶清晰、粗亮的17對引物備用。

用上述篩選到的SSR引物及相同的PCR反應程序，擴增每區植株的葉片混合DNA及其收獲種子的混合DNA。具體反應體積為20 μL，包括ddH2O 5.3 μL、10×Buffer 1 μL、dNTP 0.2 μL、Taq酶0.25 μL、SSR前后引物共1.25 μL、DNA 2 μL。反應程序為94 ℃預變性5 min，1次循環；94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，進行35次循環擴增反應；72 ℃延伸10 min。

1.4 SSR帶型讀取

在凝膠電泳圖譜上，比較葉片和種子的SSR帶型，如果兩者有差異記為“+”，無差異記為“-”。由于玉米植株的葉片DNA代表了上一代或親代的遺傳信息，而在植株上收獲的籽粒的DNA代表了下一代或子代的遺傳信息。因此，如果兩者的帶型不一致，就預示著子代在遺傳結構上發生了改變，而改變的程度用有差異的帶型數占總帶型數的比率表示。

2 結果與分析

2.1 不同孔徑的網罩隔離玉米花粉的效果

隨機調查了自然開放授粉的云玉黑甜二號的10穗籽粒數(CK1)，為102～399粒；養派四行玉米10穗的籽粒數(CK2)，為80～187粒。另外，調查了50株群體且周圍種植有眾多其他品種的緬甸四棱玉米，人工套授粉的22穗的籽粒數(CK3)，共1356粒，變幅6～137粒，其中雜籽99粒，占總數的7.3%。

由于去雄時使一些植株夭折，所以在試驗1中200目網罩內只收獲到云玉黑甜二號的9個果穗，平均每穗結籽27粒，變幅6～69粒，占CK1的5.9%～17.3%；在240目網罩內收獲到29穗，平均每穗9.2粒，變幅0～57粒，占CK1的0～14.3%；在300目網罩內收獲到11穗，平均每穗2.2粒，變幅0～7粒，占CK1的0～1.8%(表1)。

在試驗2中，在200目袋內收獲到云玉黑甜二號4穗(收獲時發現一些雌穗的花絲伸出了袋外，不納入統計)，平均每穗3.5粒，變幅0～8粒，占CK1的0～2%；在300目袋內收獲9穗，平均每穗2.6粒，變幅0～15粒，占CK1的0～3.8%。在200目袋內收獲養派四行玉米9穗，平均每穗2.8粒，變幅0～9粒，占CK2的0～4.8%；在240目袋內收獲10穗，平均每穗2.8粒，變幅0～25粒，占CK2的0～13.4%；在300目袋內收獲10穗，平均每穗0.6粒，變幅0～6粒，占CK2的0～3.2%(表1)。

表1 在不同網罩內收獲的玉米單果穗的籽粒數

注：/表示無。

從表1可以看出，隨著網罩(袋)目數增加或孔徑減小，罩(袋)內參試材料每穗粒數及占對照的比例逐漸減少，罩(袋)外的玉米花粉穿過網罩進入罩(袋)內并使雌花授粉結籽的機會也愈小，網罩(袋)隔離玉米花粉的效果愈加明顯。其中，300目網罩的隔離效果最好，在300目網罩內，每穗粒數只相當于自然開放授粉的對照穗粒數的0～4%；結籽最多的云玉黑甜二號為15粒，與CK1的102和399粒相比，相當于網罩阻擋了85.3%～96.2%的罩外花粉進入罩內。但是，如果周圍種植有其他玉米，300目的網罩仍然可使罩內的云玉黑甜二號產生4%～15%的異源籽粒。這個比例的下限雖然比CK3低1.8倍，但上限卻比CK3高2倍。

2.2 不同孔徑的網罩對玉米花粉散落的影響

由表2看出，第4穴的植株結出的紫色籽粒占總數的35.4%，紫色花粉可能來自第1穴紫色種子的植株；第6穴的占2.1%，紫色花粉可能來自第9、17穴紫色種子的植株；第12穴的占57.1%，紫色花粉可能來自第9穴紫色種子的植株。第1至第4穴、第6至第9穴、第9至第12穴，距離都是120 cm，第17至第6穴的距離為80 cm左右，這說明紫色種子的植株的雄穗花粉能散落到80～120 cm的范圍。第2穴植株結出的黃色種子占總數的6%，黃色花粉可能來自第5穴和第21穴黃色種子的植株；第2穴距離第5穴120 cm，第21穴距離第2穴80 cm左右；第8穴的黃籽占9%，黃色花粉可能來源于第5穴的黃色種子的植株，兩者相距120 cm；第16穴的黃籽占7.3%，黃色花粉可能來源于第13穴，兩者也相距120 cm。這說明黃色種子的植株的雄穗花粉也能散落到80～120 cm的范圍。

但是，由于所用試驗材料為花玉米，紫色和黃色的基因型是雜合的，其植株產生的花粉至少包含紫、黃和白色3種基因的配子，所以，試驗中紫、黃色種子的植株的雄穗花粉能讓80～120 cm的雌穗花絲授精的授粉率應在2.1%～57.1%之間。由此也說明，240目的網罩在不完全固定的方式下，對花粉的散落產生了一定影響。

表2 240目網罩內不同穴位的白色種子的植株結出的籽粒比率

注：表中順序數字表示穴位；紫、黃：表示該穴播種的種子顏色； /表示未收獲或者因植株夭折未收獲到果穗；//表示前、中、后的數字分開，分別表示紫、黃和白粒占該穴籽粒總數的比率。

2.3 不同孔徑的網罩對玉米群體遺傳結構的影響

由表3可知，17對SSR引物在玉米植株的葉片及在200、240和300目網罩內植株上收獲的籽粒之間，檢測到有差異的帶型數分別是小白糯9、9和11種，占帶型總數的52.9%、52.9%和64.7%；爆裂玉米7、8和5種，占41.2%、47.1%和29.4%；白糯玉米11、14和13種，占64.7%、82.4%和76.5%。這表明在被完全固定的情況下，不論在何種孔徑的網罩內生產的玉米籽粒，都出現了29.4%～82.4%的不同于親代的遺傳差異。所以，從遺傳學角度上看，這些種子和它們的葉片之間的遺傳相似性很低，幾乎完全可以肯定它們之間不存親子關系。因此，在被完全固定的情況下，網罩隔離造成了玉米群體遺傳結構的明顯改變。

表3 不同網罩內參試材料葉片和收獲種子的SSR帶型差異

注：+表示葉片和種子的帶型有差異，-表示葉片和種子的帶型無差異。

3 討論

玉米花粉粒的直徑大小，既有70～100 μm[8-10]，也有61.4～88.5 μm[11]，甚至40 μm[12]的文獻報道。因此，不同品種，甚至同一品種不同雄穗分枝生產的花粉粒，其大小都有可能不同。本文試驗所用3種孔徑的網罩，在理論上能阻擋75、61、48 μm以上的花粉粒，但事實上即使隔離效果最好的300目網罩也只能阻隔85%～96%的花粉，仍有4%～15%的花粉能穿過此網罩，使罩內去雄植株授精結籽。這一方面說明在云玉黑甜二號和養派四路玉米群體中存在有直徑小于48 μm的花粉粒；另一方面說明，如果試驗1周圍種植有多個且花期相近的玉米品種，這4%～15%花粉產生的籽粒便是異源雜種，這比人工套授粉出現的7.3%的誤差大很多，不能滿足玉米種質資源更新繁殖對保持遺傳完整性的要求。因此，在今后的探討研究中應考慮用大于300目，如400、500和600目，甚至更高目數的網罩做進一步的驗證試驗。

張士龍等[13]認為，在一般情況下一個玉米植株的雄穗花粉大多散落在本行之內。據張士龍等[14]的研究，雄穗使周圍雌穗花絲達到100%授粉率的輻射半徑是70 cm，花粉密度應在26粒/cm2以上，而達到90%～99%授粉率的有效輻射半徑為70～170 cm，花粉密度為23～26粒/cm2。相比之下，在網罩被不完全固定的情況下，紫色和黃色種子的植株產生的雄穗花粉雖然也能散落到半徑80～120 cm的范圍，使周圍雌穗授精結籽的授粉率為2.1%～57.1%，下降了很多。造成這種結果的主要原因可能是網罩限制了花粉的散落空間，因為留在植株頂部的網罩會給雄穗造成了一定的壓力和束縛，使其不能完全隨風自由搖動，減少了花粉散落的空間，而網罩四壁不但阻擋了風速，更進一步限制了花粉的自由散落。但是，如果能設法讓罩頂比玉米的雄穗更高一些，也許能解決這個問題。

一個玉米種質資源群體雖然內部個體間的遺傳組成是高度異質的，但群體間的遺傳成分又是相對穩定的。因而繁殖群體的大小及授粉方式等都會引起其遺傳完整性的變化。在自然、開放授粉的大群體中，群體內的個體間能夠依靠風力實現完全自由的隨機交配，所以群體的遺傳完整性可得以保持和延續。但是在小群體或有限繁殖群體中，由于個體數量減少，增加了發生自交的機會，導致群體中雜合體的比例減少、等位基因隨機波動和丟失，使得群體的遺傳結構發生隨機改變[15-16]，即遺傳漂變。已有研究表明，在玉米種質資源繁殖更新過程中，200株的群體[15-16]及半同胞或姊妹間混合授粉能較好地保持其遺傳完整性。本文用17對SSR引物擴增3種網罩內的植株葉片及收獲的玉米籽粒的DNA，發現有差異的帶型占29.4%～82.4%，這說明在網罩被完全固定的隔離模式下，參試材料原有的遺傳結構遭到了嚴重破壞。其主要原因：一是在網罩被完全固定的情況下，網罩頂部及罩內玉米植株的雄穗不能隨風搖動，使植株的雄穗花粉大都落到自己的雌穗花絲上，產生了大量的自交籽粒；二是罩外其他玉米花粉滲入罩內并使雌花授粉結籽，產生了部分異源雜種。所以，在今后的研究中，一方面要考慮網罩的固定方式，使玉米植株的雄穗有一定的散粉空間。另一方面也要考慮避免個體發生自交的管理方式，比如采取一半留雄，另一半去雄，或一穴中一株留雄、另一株去雄，或者雙行中一行留雄、另一行去雄等管理方式，成熟時收獲去雄植株的果穗籽粒留種以避免個體發生自交。另外，還要考慮網罩的合適孔徑，以便滿足玉米種質資源在更新繁育時對遺傳完整性的要求。

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(責任編輯：曾小軍)

Influence of Different Apertures of Mesh Enclosure on Maize Pollen

LONG Wen-jie, ZHOU Guo-yan*, LEI Yong-tao, WU Shao-yun**, CAI Qing**

(Institute of Biotechnology and Germplasm Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology / Key Lab of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation, Ministry of Agriculture, Kunming 650223, China)

In order to explore the alternative methods of artificial bagging and pollination for maize, this study used polyethylene mesh enclosure with 200, 240 or 300 meshes (equivalently 75, 61 or 48 μm of aperture, respectively) to isolate the heterogenous maize pollens for maize varieties Yunyuheitian No. 2, Yangpaisihang, Xiaobainuo, Baolie and Bainuo. By comparing the grain number of fruit spikes on emasculated plants, the pollen scattering distance of maize plants whose staminate flowers were remained, and the difference in SSR banding pattern between the collected leaf and harvested grain from the same plants, the author studied the impacts of different mesh enclosures on the pollen isolation, pollen scattering space, and population genetic structure of maize plants. The results showed that 300 meshes of mesh enclosure could isolate above 85% of maize pollens, and its isolated effect was better; but the mesh enclosure still had a certain limiting and constraint action to the scattering space of maize pollens even if it was incompletely fixed; the genetic structure of maize population was altered obviously by the use of mesh enclosure which was completely fixed. Therefore, mesh enclosure can isolate maize pollens, but the proper fixed mode of mesh enclosure and the management method for avoiding individual selfing within population need to be further studied.

Mesh enclosure; Isolation; Maize; Pollen

2017-01-03

國家農作物種質資源平臺(云南)(NICGR2016-030)；云南省農業科學院專項(2016YFBZ003)。

隆文杰(1982─)，男，重慶涪陵人，助理研究員，碩士，主要研究方向：玉米種質資源繁育與創新研究。*并列第一作者： 周國雁。**通訊作者：伍少云、蔡青。

S513

A

1001-8581(2017)04-0010-06