母乳中多種含鹵持久性有機污染物的聯合檢測方法

黃曉梅 馬盛韜 崔君濤 李佩 曾祥英 于志強

摘要建立了母乳中多種含鹵持久性有機污染物（POPs）的聯合檢測方法，目標化合物主要包括六溴環十二烷（HBCDs）、多溴聯苯醚（PBDEs）、多氯聯苯（PCBs）和有機氯農藥（OCPs）等。樣品的前處理采用液液萃取、凝膠滲透色譜（GPC）凈化和固相萃取（SPE）等技術，目標化合物經氣相色譜質譜聯用儀（GCMS）、液相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀（LCMS/MS）和氣相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀（GCMS/MS）等進行檢測。樣品通過GPC除去脂肪，然后經SPE柱進一步凈化并進行多組分分離，極大程度地減小了生物樣品中復雜基質的干擾，適合樣品量相對較小的人體樣本中多種超痕量POPs的分析。應用靈敏度高、選擇性更好的GCMS/MS對樣品中的PCBs和OCPs等進行分析，進一步降低基質的干擾。方法經過小牛血清加標實驗驗證，穩定可靠。POPs的加標回收率分別為88.7%～98.8%（PBDEs），88.5%～92.5%（HBCDs），67.9%～82.3%（PCBs）和81.7%～116.1%（OCPs），方法檢出限分別為0.13～1.8pg/mL（PBDEs），0.31～1.2pg/mL（HBCDs），0.22～1.4pg/mL（PCBs）和0.20～1.5pg/mL（OCPs）。采用本方法對濰坊地區20例母乳樣品進行分析，結果顯示，濰坊市母乳中HBCDs＼，PBDEs＼，PCBs、HCHs和DDTs的中值濃度分別為2.86＼，7.76＼，8.84、140和503ng/g脂重，此濃度水平與國內其它地區人群相當。

關鍵詞六溴環十二烷；多溴聯苯醚；多氯聯苯；有機氯農藥；母乳

1引言

六溴環十二烷（HBCDs）、多溴聯苯醚（PBDEs）、多氯聯苯（PCBs）和有機氯農藥（OCPs）是環境中廣泛存在的持久性有機污染物（POPs）。由于它們具有環境持久性、遠距離傳輸性、生物蓄積性以及對生物和人體具有毒害效應等特性，成為各國環境科學領域研究關注的熱點。PCBs和滴滴涕（DDT）于2001年被列入《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》首批受控POPs名單，α和β六六六（HCH）、林丹以及商用五溴和八溴聯苯醚于2009年被列入新增POPs名單，HBCDs也于2013年被列入POPs名單。盡管這些化合物在全球部分地區的應用已受到控制，但是由于長期大量使用以及持久性特征，使得其在環境介質中依然有較高的儲備，并通過食物鏈或其它途徑進入人體，帶來較大的潛在健康風險，尤其是還在使用這些化合物的地區[1]。因此，有必要持續監測這些POPs在人體內的含量水平，為評估它們的潛在健康風險提供基礎數據。

目前人體樣品中POPs的分析方法有較多報道，但已有的方法通常針對溴代阻燃劑、有機氯農藥等分類進行分析和方法優化[24]。由于母乳和血清等收集難度大，采樣量相對較小，所采集的樣品往往只能進行一次前處理；同時人體往往受到多種POPs的污染暴露，這些POPs的含量水平相對較低（ng/mL水平），因此，有必要建立適合人體樣品多種痕量POPs的聯合檢測方法，從而實現有限的樣品量經一次分析得到多種POPs的濃度水平，這也是當前POPs分析方法發展的主要方向。目前，有關人體樣品的多組分聯合檢測方法的文獻報道較少。Sahlstrm等[5]建立了血清中多種溴阻燃劑聯合檢測方法，該方法在提取脂肪后，將耐酸性化合物與對酸敏感的化合物用固相萃取（SPE）柱分離，然后將二者分開凈化，操作較復雜。Shi等[6]建立了母乳和血清中HBCDs、PBDEs和四溴雙酚A（TBBPA）的聯合檢測方法，Wang等[7]建立了血清中PCBs、OCPs、PBDEs、德克隆（DP）、五溴苯（PBBz）和五溴甲苯（PBT）的聯合檢測方法，以上兩種方法在利用凝膠滲透色譜（GPC）除脂后，分別用濃硫酸和酸性硅膠柱進一步凈化。人體樣品的基質非常復雜，在濃硫酸或酸性硅膠凈化過程中，生物基質與濃硫酸反應生成的產物可能干擾POPs的檢測，母乳中的膽固醇經濃硫酸脫水后形成膽甾烯，后者在GCMS檢測時對BDE99和BDE100產生離子抑制效應或峰干擾效應[8]。

本研究利用液液萃取、GPC凈化和SPE分離等技術，建立了母乳樣品中HBCDs，PBDEs，PCBs和OCPs等多種POPs的聯合檢測方法；同時利用靈敏度高和選擇性好的GCMS/MS對樣品中PCBs和OCPs進行檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

7890A5975C氣相色譜質譜聯用儀、7890A7000氣相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；1100液相色譜（LC，美國安捷倫公司）耦合應用生物系統API4000三重四極桿串聯質譜系統（MS/MS，美國AB公司）；BS210s電子天平（德國Sartorius公司）；TDL5A離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；R210旋轉蒸發儀（瑞士步琪公司）；50mL聚四氟乙烯離心管（美國橡樹嶺公司）等。

PCBs混合標樣（包含PCB28＼，52＼，101＼，118＼，138＼，153＼，180），PBDEs混合標樣（包含BDE28＼，47＼，99＼，100＼，153＼，154＼，183＼，209），高溴PBDE單標（BDE196＼，197＼，201＼，202＼，203＼，206＼，207＼，208＼，209），以及單標BDE77＼，BDE128＼，BDE181均購自美國Accustandard；α、β、γHBCD，13C12標記和d18標記的α＼，β＼，γHBCD，13C10PCB141，13C10PCB208，以及13COCPs（含13C6標記的βHCH＼，13C12標記的4，4′DDE和4，4′DDT）均購自美國劍橋同位素實驗室；OCPs混標（含αHCH＼，βHCH＼，γHCH＼，4，4′DDD＼，4，4′DDE＼，4，4′DDT）購自美國Supelco公司。

二氯甲烷（農殘級，德國CNW公司）；正己烷和甲醇（LC級，德國Merck公司）；甲基叔丁基醚和乙醇（LC級，德國CNW公司）；草酸鉀（99%，美國AlfaAesar公司）；無水硫酸鈉（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；凝膠滲透色譜填料為BioBeadsSX3（美國BioRad公司）；硅膠（63200μm，德國Merck公司）。

2.2實驗用品的制備

玻璃器具用熱洗液（含5%K2Cr2O7的濃H2SO4）清洗，放置5h后，依次用自來水和去離子水清洗，烘干后，經450℃高溫焙燒5h后，用鋁箔紙封口保存備用。無水硫酸鈉經450℃高溫焙燒5h后，置于密封干燥器中保存備用。硅膠經150℃活化12h后，在干燥器中平衡12h，加入2.5%（m/m）的水失活，置于密封干燥器中備用。

2.3母乳樣品的采集

母乳樣品于2010年11月至2011年03月采自山東省濰坊某醫院。所有志愿者都自愿參加并簽署知情同意書，在該醫院醫護人員的協助下，收集母乳量約20mL。母乳樣品置于

80℃冰箱保存。同時對參與人員進行無記名登記調查，記錄相應母親的年齡、胎次、職業等信息。

2.4樣品處理

基于本課題組建立的母乳中PBDEs的分析方法[9]，建立母乳樣品中POPs多組分聯合檢測方法。樣品依次經過脂肪提取、GPC除脂和SPE分離純化等過程。

2.4.1脂肪提取取5mL解凍后的母乳樣品，加入加標指示物（BDE77，BDE128，BDE181，13C6標記的βHCH，13C12標記的4，4′DDE和4，4′DDT，13C10標記的PCB141，13C12標記的α，β，γHBCD），振蕩后平衡12h。加入5mL水稀釋母乳，再加入1mL飽和草酸鉀溶液和10mL乙醇使蛋白質變性并沉淀。用10mL甲基叔丁基醚和正己烷混合溶液（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）萃取一次，再用5mL正己烷萃取兩次。合并有機萃取液，無水Na4SO4除水，旋轉蒸發儀濃縮至1mL，轉移至細胞瓶并用柔和氮氣吹干，放入干燥器中恒重后，稱量脂肪的質量。

2.4.2GPC凈化與SPE分離

恒重后的脂肪溶于1mL正己烷二氯甲烷混合溶液（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）中，通過GPC除去脂肪等大分子，收集55～175mL淋洗液，經旋轉蒸發儀濃縮至1mL。濃縮液經SPE柱（填料是以2.5%水失活的中性硅膠，0.50g）分離非極性組分與極性組分。非極性組分（F1，含PBDEs，PCBs，DDTs等）由10mL正己烷洗脫下來，氮吹濃縮至1mL后，轉移至進樣瓶，氮吹至干，加入進樣內標（13C10PCB208），定容至20μL異辛烷中。極性組分（F2組分，含HBCDs、HCHs等）用7mL正己烷二氯甲烷混合溶液（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）洗脫，氮吹濃縮至1mL后，轉移至進樣瓶，氮吹至干，加入進樣內標（13C10PCB208），定容至20μL正己烷中。F2組分先經GCMS/MS檢測OCPs的含量，再將溶劑切換至200μL甲醇中，加入進樣內標（d18標記的α，β，γHBCD），經LCMS/MS檢測HBCDs的含量。

2.5儀器分析

2.5.1GCNCIMS測定PBDEs色譜條件：DB5HT高溫毛細管柱（15m×0.25mmi.d.，0.10μm，J&WScientific公司）；載氣為氦氣（1.2mL/min），恒流模式；無分流模式，進樣量為1μL；進樣口溫度為290℃。色譜柱初始溫度為110℃，保持5min；以20℃/min升至200℃，保持4.5min；以7.5℃/min升至300℃，保持10min。質譜采用負化學電離源（NCI）：甲烷為反應氣（2mL/min）；離子源溫度為250℃；四極桿溫度為150℃；傳輸線溫度為300℃。采用選擇離子監測模式（SIM），進行定性與定量分析，監測離子分別為13C10PCB208：m/z473.7和m/z475.7；3～8溴PBDEs：m/z79和m/z81；9～10溴PBDEs：m/z79、m/z81、m/z486.7和m/z488.7。

2.5.2GCMS/MS測定PCBs和OCPs色譜條件：DB5MS（30m×0.25mmi.d.，0.25μm，J&WScientific公司）；載氣為高純氦氣（1.2mL/min），恒流模式；無分流模式，進樣量為1μL；進樣口溫度為250℃。色譜柱初始溫度為70℃（保持1min），以10℃/min升溫至160℃，以5℃/min升至280℃（保持5min），以20℃/min升至300℃（保持5min）。質譜采用電子轟擊離子源（EI）：碰撞氣為高純氦氣和高純氮氣，淬滅氣為高純氦氣；離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；傳輸線溫度為300℃。

2.5.3LCMS/MS測定HBCDsZorbaxSBC18反相色譜柱（250mm×4.6mmi.d.，5μm，Agilent公司）；進樣量為20μL；流動相組成為水（A）/甲醇（B）/乙腈（C），流速為0.5mL/min；初始流動相組成為A〖KG-3∶〖KG-5B〖KG-3∶〖KG-5C=10〖KG-3∶〖KG-580〖KG-3∶〖KG-510（V/V，下同），在18min內緩慢調整為A〖KG-3∶〖KG-5B〖KG-3∶〖KG-5C=10〖KG-3∶〖KG-550〖KG-3∶〖KG-540，23min時調整為B〖KG-3∶〖KG-5C=30〖KG-3∶〖KG-570（保持7min），然后在5min內調整為A〖KG-3∶〖KG-5B〖KG-3∶〖KG-5C=10〖KG-3∶〖KG-580〖KG-3∶〖KG-510，最后色譜柱平衡10min。質譜分析采用負離子電噴霧離子源（ESI）和多重離子裂解監測模式（MRM），監測離子對為＼[M-H＼]

→Br

；高純氮氣為輔助氣、簾氣和碰撞氣；13C12標記的、d18標記的以及未標記的HBCDs的監測離子對分別為m/z652.7→78.8，m/z658.7→78.8，m/z640.7→78.8。

3結果與討論

3.1SPE柱分離與凈化流程的優化

母乳樣品經GPC凈化后，已除去大部分脂肪和蛋白質等大分子基質，對于小分子基質，利用它們與目標化合物在硅膠上的吸附特征不同，通過硅膠SPE柱進一步分離凈化，最大程度減小儀器分析時生物基質的干擾。

在利用SPE柱凈化的同時，通過改變洗脫劑的極性將母乳樣品中目標化合物分成兩個組分：F1組分包括PCBs、PBDEs和DDTs等，F2組分主要是HCHs和HBCDs。首先以正己烷為洗脫劑將非極性組分洗脫下來，然后增加洗脫劑的極性（正己烷二氯甲烷，1〖KG-3∶〖KG-51，V/V），將一定極性的化合物洗脫下來，極性更強的小分子基質則保留在SPE柱上，從而達到分離與凈化的目的。

3.2PCBs和OCPs檢測方法的優化

母乳中PCBs和OCPs的含量采用GCMS/MS測定。母乳樣品中目標化合物經SPE柱分離后，盡管DDTs與HCHs在不同的組分，但是PCBs與DDTs均在同一組分，故建立PCBs和DDTs同時檢測方法，可以減少進樣次數，提高實驗效率。首先，在質譜單掃描模式下，對PCBs和DDTs目標化合物分別進行全掃描（Fullscan，m/z50～500），確定每個化合物的特征碎片離子；然后，將特征碎片離子作為母離子，進行子離子掃描，確定每個目標化合物的定性和定量離子對；最后，通過多級反應監測模式（MRM），對每個化合物的碰撞能等參數逐一優化，使其達到最優。以同樣的方法優化HCHs的儀器參數。最終確定的OCPs和PCBs的定性和定量離子對以及碰撞能如表1所示。

3.3檢出限、回收率及重現性

配制2.5，5，10，25，50，100，200和400ng/mL的混合標準溶液，以標準品與內標濃度比值為Y軸，標準品與內標峰面積比值為X軸，繪制標準曲線。目標化合物在相應濃度范圍內線性良好，相關系數R2≥0.998。取信噪比大于5時的標準溶液，連續進樣6次，計算標準偏差S，根據檢出限（LOD）=3.36S，計算PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的儀器檢出限分別為0.06～0.25pg/μL，0.08～0.19pg/μL，0.07～0.28pg/μL和0.07～0.18pg/μL。以低濃度的母乳（5mL）為基準，PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的方法檢出限分別為0.13～1.8pg/mL＼，0.31～1.2pg/mL＼，0.22～1.4pg/mL和0.20～1.5pg/mL。

由于母乳樣品采集難度大且樣品量相對較小，以及母乳中含有一定濃度的目標化合物，尤其是DDTs和HCHs（我國12省普通地區人群所有母乳中均檢測到DDTs和HCHs，其最低含量分別高達149和52ng/g脂重[10]），故分析方法的研究中一般不用母乳進行測定。以往文獻中曾使用牛奶作為基質進行加標實驗[10～12]，Shi等[6]在建立血清和母乳中HBCDs、PBDEs和TBBPA的聯合分析方法時，分別用新生小牛血清和牛奶進行基質加標實驗，結果顯示，兩種基質中目標化合物的回收率一致，但是牛奶中目標化合物回收率的相對標準偏差（RSD）顯著大于新生小牛血清，尤其是αHBCD（13.9%vs2.7%）和βHBCDs（14.0%vs1.7%）。本研究中也有同樣的發現，牛奶作為基質的方法穩定性較差，而新生小牛血清中加標指示物的回收率和RSD值與母乳接近（表2），證實新生小牛血清可以替代母乳用于基質加標實驗。因此，本研究采用新生小牛血清（5mL）進行基質加標實驗，表3列出了各目標化合物的加標回收率。PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的加標回收率分別為88.7%～98.8%＼，88.5%～〖CM（4492.5%＼，67.9%～82.3%和81.7%～116.1%，其RSD值分別為8.7%～11.7%、3.6%～4.0%、0.72%～〖CM）

5.5%和7.5%～11.1%，表明本研究建立的多組分聯合檢測方法穩定可靠。

將本方法與文獻報道的人體樣品中多組分聯合分析方法進行比較（表4）可知，本方法具有良好的加標回收率和較低的方法檢出限，能滿足實際樣品測定的要求。

3.4實際樣品的分析

將本研究方法應用于山東濰坊市20份母乳樣品中PBDEs，HBCDs，PCBs和OCPs的分析。圖1是母乳樣品中POPs的典型色譜圖。高溴PBDEs（8～10溴）是濰坊母乳樣品中主要的PBDEs同系物，與本課題組報道的上海地區人群母乳類似[9]。參考高溴PBDEs標準物質，鑒定母乳中高溴PBDEs的同系物組成如圖1A所示。αHBCD是濰坊母乳中最主要的HBCD異構體（圖1B），與Shi等[15]報道的我國12省普通人群母乳類似。PCB28和PCB153是母乳中最主要的PCBs同系物（圖1C），這與我國12省飲食中PCBs的組成特征類似[16]。4，4′DDE和βHCH分別是母乳中最主要的DDTs和HCHs（圖1C〖CM（44和圖1D），與國內其它地區普通人群母乳類似[10]。母乳樣品中POPs的濃度如圖2所示，HBCDs，〖CM）

PBDEs＼，PCBs＼，HCHs和DDTs的中值濃度分別為2.86＼，7.76＼，8.84＼，140和503ng/g脂重，該濃度水平與我國其它地區普通人群相當[9，10，12，17]。其中，DDTs的含量最高，HCHs次之，與中國疾病預防控制中心對我國12省普通人群的POPs內暴露調查結果一致[10，15，17]，表明我國普通人群以DDTs和HCHs為〖CM（44主的暴露特征。這與我國歷史上曾大量生產和使用DDTs和HCHs，以及它們在環境和生物體內難以降解轉化有關。

4結論

本研究建立了母乳樣品中HBCDs，PBDEs，PCBs和OCPs等多種POPs的聯合檢測方法，利用GPC除脂，有效避免了濃硫酸在除脂過程中帶入新的基質干擾，并用SPE柱進一步凈化，極大程度降低了生物樣品中復雜基質的干擾。另外，本研究利用靈敏度高和選擇性好的GCMS/MS檢測OCPs和PCBs的含量，進一步降低了生物基質的干擾。本方法具有良好的加標回收率和較好的重復性，適合于實際母乳樣品中HBCDs、PBDEs、PCBs和OCPs等多種POPs的聯合分析檢測。

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AbstractAmethodwasdevelopedforsimultaneousdeterminationofmultiplepersistentorganicpollutants（POPs）suchashexabromocyclododecanes（HBCDs），polybrominateddiphenylethers（PBDEs），polychlorinatedbiphenyls（PCBs），andorganochlorinepesticides（OCPs）inhumanbreastmilk.Thesamplepretreatmentproceduresincludedliquidliquidextraction，gelpermeationchromatography（GPC），andsolidphaseextraction（SPE）cleanup.Gaschromatographycoupledwithmassspectrometry（GCMS），liquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry（LCMS/MS），andgaschromatographycoupledtotandemmassspectrometry（GCMS/MS）wereappliedinanalysisofthetargetcompounds.ByusingGPCtoremovehighmolecularmasslipidsandSPEforfurthercleanupandseparationoftargetcompounds，theinterferencesofbiologicalmatrixweregreatlyreduced.ThedevelopedsamplepretreatmentprocedurewassuitableforthemulticomponentanalysisofPOPsinhumansampleswhichhadverylowerPOPsconcentrationsandsmallersamplevolumes.ThesimultaneousdeterminationofPCBsandOCPsbyGCMS/MSexhibitedexcellentsensitivityandselectivity.Themethodrecoveriesweretestedbyspikedtargetcompoundsintofetalbovineserumsamples.Therecoverieswere88.7%-98.8%forPBDEs，88.5%-92.5%forHBCDs，67.9%-82.3%forPCBs，and81.7%-116.1%forOCPs，respectively.Limitsofdetectionofthemethodwereintherangeof0.13-1.8ng/LforPBDEs，0.31-1.2ng/LforHBCDs，0.22-1.4ng/LforPCBs，and0.20-1.5ng/LforOCPs，respectively.Finally，thedevelopedmethodwasappliedinPOPsanalysisof20humanbreastmilksamplesfromWeifangcity.TheresultsshowedthatthemedianconcentrationsofHBCDs，PBDEs，PCB，HCHSandDDTswere2.86，7.76，8.84，140and503ng/glipidweight，respectively.LevelsofthetargetcompoundswerecomparabletothosereportedinhumanbreastmilkforgeneralpopulationfromotherregionsinChina.

KeywordsHexabromocyclododecanes；Polybrominateddiphenylethers；Polychlorinatedbiphenyls；Organochlorinepesticides；Humanbreastmilk

（Received30September2016；accepted11January2017）

ThisworkwassupportedbytheNationalScienceFoundationforDistinguishedYoungScholarsofChina（No.41225013）andthestrategicpriorityResearchProgramoftheChineseAcademyofSciences（No.XDB14010202）