液相色譜串聯質譜法測定蜂產品中吡蟲啉及其3種代謝物

梁秀美 ??王祥云 ??薛曉鋒 ??齊沛沛 ??劉真真?ち踔?煒 ??周莉 ??王新全 ??王強

摘要建立了蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的液相色譜串聯質譜（LCMS/MS）檢測方法。在QuEChERS方法基礎上，針對目標物化學性質和樣品雜質情況，對提取溶液的pH值、提取次數、凈化材料等參數進行了優化。最終以5%甲酸乙腈溶液提取兩次，無水MgSO4、NaCl鹽析分層，提取液經增強型脂類去除材料（EMR）凈化，以LCMS/MS進行測定，基質外標法進行定量分析。結果表明，蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的平均加標回收率為86.0%～111.5%，相對標準偏差在1.7%～9.6%之間，檢出限分別為0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，定量限分別為0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg。本方法分析速度快、靈敏度高、重現性好，適用于蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其3種代謝物的快速測定。

關鍵詞液相色譜串聯質譜；蜂蜜；蜂花粉；吡蟲啉；吡蟲啉烯烴；吡蟲啉脲；6氯煙酸；增強型脂類去除材料

1引言

新煙堿類殺蟲劑為昆蟲乙酰膽堿受體激動劑，是繼有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類等殺蟲劑之后的第四大類殺蟲劑[1]。吡蟲啉是其代表性藥劑，主要用于防治水稻、小麥、棉田中的蚜蟲、葉蟬、飛虱等30多種刺吸式口器害蟲、地下害蟲[2]。

吡蟲啉對哺乳動物低毒，但對蜜蜂具有較大的潛在毒副作用[3]，主要包括高濃度下的急性毒性以及亞致死濃度下的學習能力降低[4]、記憶力下降[4，5]、出現非正常的覓食行為[6]及群勢衰弱[7]等慢性毒性[8]。鑒于吡蟲啉對蜜蜂的毒害作用，環保署與美國農業部于2013年4月重申“使蜂群遠離新煙堿類農藥”是保護蜂群的必要舉措[3]。Severine等[9]的研究結果表明，吡蟲啉的烯烴代謝物等具有與其母體相似的蜜蜂毒性，因此在評估蜂產品中吡蟲啉殘留對蜜蜂的風險時，應涵蓋其代謝物殘留的影響。吡蟲啉及其部分代謝物的化學結構式見表1。

吡蟲啉殘留的分析檢測方法較多，主要有液相色譜法[10，11]、液相色譜串聯質譜法[12，13]，但其代謝物的檢測方法較少[14，15]。Kamel等[14]建立了花蜜和花粉中吡蟲啉、噻蟲嗪、呋蟲胺及其代謝物的LCMS/MS檢測方法，以2%三乙胺乙腈提取、經C18小柱凈化、氮吹濃縮后過膜進樣，操作較為繁瑣。Garcia等[15]建立了蜜蜂中吡蟲啉和6氯煙酸的LC檢測方法，該方法需要兩次抽濾、兩次萃取、旋蒸濃縮等步驟，且未涵蓋吡蟲啉烯烴及吡蟲啉脲。本研究基于較為成熟的QuEChERS農藥殘留快速檢測方法＼[16]，建立了蜂蜜和蜂花粉樣品中吡蟲啉以及吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲和6氯煙酸等3種代謝物殘留量的LCMS/MS快速檢測方法。經優化后，本方法以酸化乙腈提取兩次，確保目標物的提取效率，以新型凈化脫脂材料EMR替代傳統的分散固相萃取凈化材料，得到更佳的凈化效果。結果表明，本方法簡便、快速、準確、靈敏，可滿足蜂蜜和蜂花粉中吡蟲啉及其3種代謝物的快速測定要求。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC30A液相色譜儀（日本島津公司）；4500型三重四極桿串聯質譜（美國ABSCIEX公司）；68905975氣相色譜質譜儀（美國Agilent公司）；HeraeusBiofugePrimoR離心機（美國ThermoScientific公司）；MTN2800D氮吹儀（北京華博科技制造有限公司）；QT2旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；BSA2202S電子天平（北京塞多利斯科學儀器有限公司）；0.22μm濾膜（天津博納艾杰爾公司）。

蜂產品（蜂蜜和蜂花粉，本地超市，本方法測定無吡蟲啉及其代謝物殘留）；吡蟲啉標準品（1000mg/L，農業部環境質量監督檢驗測試中心（天津））；吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸標準品（純度均為99.0%，德國Dr.EhrenstorferGmbH公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸銨（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；三乙胺（TEA，色譜純，美國ROEScientific有限公司）；QuEChERSKits提取粉（6g無水MgSO4、1.5gNaCl）、十八烷基硅烷（C18）、乙二胺N丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB），均購自天津博納艾杰爾公司；ZSep（55299U，美國Supelco公司）；EMR凈化管（59821010，美國Agilent公司）；無水MgSO4（分析純，永華化學科技（江蘇）有限公司）；實驗用水為超純水（MilliQ，美國Millipore公司）。

單標儲備液：以乙腈定容，配制成質量濃度分別為40，388，420和879mg/L的吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸單標儲備液，于4℃保存。

混標工作液：分別準確移取適量上述單標儲備液，以乙腈定容，配成吡蟲啉質量濃度為1mg/L的吡蟲啉混標（吡蟲啉〖KG-3∶〖KG-5吡蟲啉烯烴〖KG-3∶〖KG-5吡蟲啉脲〖KG-3∶〖KG-56氯煙酸=1.0〖KG-3∶〖KG-519.4〖KG-3∶〖KG-52.0〖KG-3∶〖KG-575.0，m/m）儲備液。于4℃保存，用時稀釋成所需濃度。

2.2樣品前處理

準確稱?。?.00±0.05）g蜂產品于50mL離心管中，加入10mL水，渦旋混勻；隨后加入10mL5%甲酸乙腈溶液，渦旋混勻3min，再加入QuEChERSKits提取粉，立即手動劇烈振搖30s，7000r/min離心3min。取上清液于另一個50mL離心管；下層樣品再加5mL5%甲酸乙腈溶液重復提取一次，合并提取液，待凈化。

EMR凈化管預先加2mL水渦旋混勻30s進行活化；加入5mL上述提取液，渦旋混勻30s后，7000r/min離心3min；隨后取全部上清液加1.4g無水MgSO4，以除去水分，渦旋混勻30s后，7000r/min離心3min。取0.5mL上清液于2mL離心管中，加入0.5mL水混勻，過0.22μm濾膜，待LCMS/MS測定。

2.3LCMS/MS測定條件

采用文獻＼[14＼]中的儀器條件：UPLCHSST3色譜柱（10cm×2.1mm×1.8μm，美國Waters公司）；流動相A為水，流動相B為5mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～15min，95%A；15～16min，60%A；16～17min，5%A；17～19min，95%A。流速0.35mL/min，柱溫40℃，進樣量5μL。

質譜采用電噴霧離子源（ESI），正負離子切換掃描方式，選擇多反應監測（MRM）模式，噴霧電壓4000V，毛細管溫度350℃；氣簾氣（400Pa）、碰撞氣（7Pa）、噴霧氣（30Pa）和輔助噴霧氣（30Pa）均為氮氣。各化合物的質譜采集參數見表1。

3結果與討論

3.1溶液pH值對提取效率的影響

6氯煙酸為酸性化合物，因此本研究首先考察了2%三乙胺乙腈、乙腈、0.1%～5%甲酸乙腈等不同pH值溶劑對提取效率的影響。取一定濃度的吡蟲啉混標溶液于離心管中，加H2O、NaCl和不同pH值的乙腈，渦旋混勻、離心后，取等體積的上層有機相和水，混勻過膜，待LCMS/MS測定。由圖1可知，在2%三乙胺乙腈、乙腈的提取環境下，6氯煙酸的提取效率較低，這可能是因為在堿性和中性環境下〖CM（446氯煙酸以離子形式溶解于水中，降低了溶劑的提取效率；而在酸性條件下，6氯煙酸的提取效率顯著〖CM）

增強。而文獻＼[14＼]表明，以2%三乙胺乙腈提取后，經C18柱凈化，LCMS/MS測定，6氯煙酸的回收率在64.1%～93.0%之間，即2%三乙胺乙腈對6氯煙酸具有良好的提取效果，這與本實驗的結果存在一定的差異。為保障6氯煙酸的提取效率，同時兼顧其它待測物的回收率情況，本實驗最終選擇5%甲酸乙腈為提取溶液。

3.2凈化過程

蜂花粉雖然源于植物花粉，但在其生產過程中，蜜蜂通過混入蠟腺分泌物而形成，從而含有較多蠟質。Wiesta等[17]采用正己烷萃取和冷凍等方法去除了蜂花粉中的油脂。本研究也進行了相應的嘗試，但效果并不理想。此外，文獻＼[18，19＼]報道ZSep和EMR等凈化材料對于油脂類干擾具有較好的去除效果。因此，本實驗在QuEChERS方法常用凈化材料C18、PSA、GCB之外，對ZSep、EMR等新型凈化材料進行了考察。取樣品提取液，分別采用C18，PSA，GCB或ZSep等材料進行凈化；或取樣品提取液于EMR凈化管中凈化（方法同2.2節），凈化后經脫水過膜，以GCMS測定，其總離子流圖（TIC，圖2和圖3）表明，蜂蜜提取液本身較為純凈，5種凈化材料均可滿足實驗要求；蜂花粉提取液則有較多的干擾物質，5種凈化材料均有一定的凈化效果，其中EMR的凈化效果明顯優于其它4種凈化材料。其原因可能是EMR通過疏水作用選擇性吸附長鏈脂類，形成脂類EMR聯合體，并通過離心沉淀或溶于水相的形式實現對提取液的有效凈化[19]。

3.3凈化材料對回收率的影響

文獻＼[14＼]表明，在2%三乙胺乙腈的提取條件下，PSA對6氯煙酸具有強烈的吸附作用，導致添加樣品中6氯煙酸回收率為0。因此，本研究在5%甲酸乙腈的提取條件下，考察了C18、PSA、GCB、ZSep、EMR等備選凈化材料對待測物回收率的影響。除在空白基質提取液（見2.2節）加入一定濃度的標準溶液以及采用LCMS/MS測定外，其余步驟同3.2節。結果見圖4，在5%甲酸乙腈提取條件下，除GCB對6氯煙酸有吸附外，其它凈化材料對回收率均無明顯影響。GCB對6氯煙酸的吸附則源于6氯煙酸本身的平面結構[16，20]。

3.4基質效應

采用LCMS/MS進行殘留測定時應盡量避免基質效應[21]，同時基質效應也可反映凈化效果。為比較C18、PSA、ZSep和EMR的凈化效果，分別以4種材料對蜂蜜、蜂花粉提取液（見2.2節）進行凈化，并配制吡蟲啉及其代謝物的系列濃度基質標準溶液，同時配制相應的溶劑標準溶液。經LCMS/MS測定后，以化合物的峰面積和濃度作圖，繪制標準曲線。以不同基質標準線性回歸方程的斜率與溶劑標準液的斜率比值評判基質效應的程度：比值>1，表明存在基質增強效應；比值<1，存在基質抑制效應；比值越接近1，則基質效應越小，凈化效果越好；當比值遠離1，表明存在明顯的基質效應，必要時需進一步凈化。本實驗結果表明，經C18、PSA、ZSep、EMR分別凈化后，蜂蜜中吡蟲啉及其3種代謝物的比值在0.96～1.06之間，基質效應輕微。蜂花粉提取液中的基質效應較強，具體結果如圖5所示：除6氯煙酸存在一定的基質增強效應，其余待測物均呈現出明顯的基質抑制效應；其中C18、PSA、ZSep和EMR抑制效應總體呈依次減弱，這也說明其凈化效果依次增強。雖然ZSep和EMR的基質效應較為接近，考慮到其在3.2節實驗中表現出了最佳的凈化效果，本實驗最終選擇EMR作為凈化材料。

3.5確定提取次數

為確保蜂蜜，尤其是蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物的提取效率，進一步考察了提取次數的影響。結果表明，蜂蜜中的待測物在第2次提取時仍有1%～5%的殘留，而第3次提取時則僅有<0.5%的殘留；蜂花粉中的待測物提取效率相對較低，第2次提取時尚有6%～16%的殘留，第3次提取時仍有約3%的殘留。因此，兩次提取即可將蜂蜜和蜂花粉中97%以上的待測物充分提取。本實驗最終對蜂蜜和蜂花粉樣品進行兩次提取，以確保提取效率。

3.6線性范圍、檢出限和定量限

在2.3節的色譜條件下，配制吡蟲啉及其代謝物的系列基質標準溶液，經LCMS/MS測定后，以化合物的峰面積和濃度做圖，繪制標準曲線。以添加回收樣品峰響應值為3倍噪音的添加濃度為方法檢出限（LOD），以10倍噪音的添加濃度為方法定量限（LOQ）。具體結果見表2，在蜂蜜和蜂花粉中，2吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6氯煙酸的LOD分別為0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，LOQ分別為0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg，相關系數在0.9992～1.0000之間，能夠滿足定量分析的基本要求。

3.7準確度和精密度

在蜂蜜和蜂花粉中添加適當體積的吡蟲啉混合標準溶液，使添加水平均分別為LOQ，5LOQ和10LOQ。由表3可知，在蜂蜜和蜂花粉中，4種化合物的平均加標回收率在86.0%～111.5%之間，相對標準偏差（RSD）在1.7%～9.6%之間，方法具有較好的回收率和重現性。

[LM][HT5”SS][HJ*4]表3蜂蜜和蜂花粉中的加樣回收率和相對標準偏差（n=5）

Table3RecoveryandRSDofspikedhoneyandpollen（n=5）

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AbstractAmethodwasdevelopedforthedeterminationofimidaclopridanditsmetabolitesimidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandbeepollenbyliquidchromatographytandemmassspectrometry（LCMS/MS）.OnthebasisoftypicalQuEChERSmethod，thepHandtimesofextractionsolvent，sorbentswereoptimizedtoensuretheextractionefficiencyandthepurificationofextraction.Finally，themethodwasdevelopedasfollows：matrixwasextractedwith5%formicacidacetonitriletwice，andtheextractionwascleanedwithenhancedmatrixremovallipid（EMR），detectedwithLCMS/MSandquantifiedwithexternalmatrixstandards.Theresultsindicatedthattheaveragespikedrecoveriesofimidacloprid，imidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandpollensampleswere86.0%-111.5%withrelativestandarddeviations（RSDs）of1.7%-9.6%，theLODswere0.20，3.50，0.40and14.00μg/kg，andtheLOQswere0.60，11.64，1.20and45.00μg/kg.Themethodwasrapidandsimplewithhighsensitivityandgoodreproducibility，andsuitableforthedeterminationofimidaclopridanditsthreemetabolitesresiduesinhoneyandbeepollen.

KeywordsLiquidchromatographytandemmassspectrometry；Honey；Hollen；Imidacloprid；Imidaclopridolefin；Imidaclopridurea；6Chloronicotinicacid；EnhancedmatrixremovalLipid

（Received15November2016；accepted6February2017）