液相色譜串聯質譜法測定果蔬中雙三氟蟲脲、四氯蟲酰胺和氰蟲酰胺殘留

崔淑華 李瑞娟 張曉梅 程剛 王宇 李正義

摘要建立了蔬菜和水果中雙三氟蟲脲、四氯蟲酰胺和氰蟲酰胺3種新型殺蟲劑的分散固相萃取液相色譜串聯質譜檢測方法。樣品經乙腈均質提取，混合使用乙二胺N丙基硅烷（PSA）和C18基質分散凈化劑進行凈化，液相色譜三重四極桿串聯質譜（LCMS/MS）同時進行檢測。雙三氟蟲脲和四氯蟲酰胺采用多反應監測負離子模式，氰蟲酰胺采用多反應監測正離子模式。雙三氟蟲脲在蘋果、洋蔥和經微波處理的洋蔥樣品中均不存在基質效應，可采用純溶劑標準外標法或者采用基質匹配標準溶液定量檢測；四氯蟲酰胺和氰蟲酰胺存在程度不同的基質減弱效應，采用空白基質匹配的校正標準曲線外標法定量。3種殺蟲劑均在0.2～100μg/L線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.9990。在0.005～2.000mg/kg范圍內，平均添加回收率為81.6%～99.9%，相對標準偏差為3.6%～9.8%。氰蟲酰胺、四氯蟲酰胺和雙三氟蟲脲的檢出限分別為0.064，0.048和0.001μg/kg，定量限分別為0.210，0.160和0.004μg/kg。

關鍵詞液相色譜串聯質譜；水果和蔬菜；雙三氟蟲脲；四氯蟲酰胺；氰蟲酰胺

1引言

鱗翅目害蟲是我國大部分地區蔬菜和水果生產中的主要害蟲[1]。使用選擇性好、環境相容性好、無公害、活性高、與傳統殺蟲劑不存在交互抗性等特性的殺蟲劑防治害蟲已成為目前的應用趨勢。雙三氟蟲脲（Bistrifluron，商品名為Hanaro）能抑制昆蟲幾丁質形成，影響內表皮生成，使昆蟲不能順利蛻皮而死亡[2～4]。氰蟲酰胺（又名溴氰蟲酰胺，Cyantraniliprole）和四氯蟲酰胺（SYP9080，化學名稱為3溴N＼[2，4二氯6（甲氨基甲酰基）苯基＼]1（3，5二氯2吡啶基）1H吡唑5甲酰胺）作為魚尼丁受體激活劑，是新型雙酰胺類殺蟲劑。這些新型殺蟲劑不僅對鱗翅目等害蟲有優良的活性，與現有殺蟲劑無交互抗性，而且對哺乳動物安全，適用范圍廣[5～9]。

隨著雙三氟蟲脲、氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺的推廣使用，作為我國蔬菜、水果主要出口市場的美國、韓國、日本等國家對其制定了殘留限量標準。韓國規定雙三氟蟲脲在黃瓜、大蔥、白菜、辣椒、甜椒等蔬菜中的最大允許殘留量為0.2～2.0mg/kg、在葡萄、草莓、西瓜、蘋果、桃子、梨等水果中的最大允許殘留量（MRL）為0.2～1.0mg/kg；2014年2月5日，美國環保署發布對氰蟲酰胺（Cyantraniliprole）的MRL為0.02～30.00mg/kg。對四氯蟲酰胺，歐盟和日本規定以0.01mg/kg為限值，美國規定不得檢出[10]。

目前，對果蔬中氰蟲酰胺殘留一般采用QuEChERS方法進行前處理，高效液相色譜串聯質譜（HPLCMS/MS）進行檢測[11～16]；對果蔬中雙三氟蟲脲和四氯蟲酰胺殘留量檢測方法，目前僅有幾個申請專利[17～20]，也采用QuEChERS的前處理方法，HPLCMS/MS和GCMS進行檢測。目前尚未見同時檢測果蔬中這3種新型殺蟲劑殘留量的研究報道。QuEChERS前處理方法簡便快捷，已成為現階段應用最廣泛的前處理方法，但由于不同農藥的性質不同，需采用加標回收方法驗證。同時，使用HPLCMS/MS分析時，還可能存在基質效應問題。本研究對儀器檢測方式、樣品基質等因素對基質效應的影響進行了分析，在優化QuEChERS基質固相分散萃取條件的基礎上，建立了HPLCMS/MS同時測定果蔬中雙三氟蟲脲、四氯蟲酰胺和氰蟲酰胺殘留的檢測方法，并用于檢測實際樣品，結果令人滿意。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent12906460液相色譜串聯質譜儀（配ESI離子源，美國Agilent公司）；3K15型離心機（德國Sigma公司）；ULTRATURRAXT18basic型均質器（IKA公司，德國）；MilliQ超純水儀（美國Millipore公司）；Vortex3000型旋渦混合器（德國Wiggens公司）。

雙三氟蟲脲標準品（純度≥98.0%，德國Sigma公司）；氰蟲酰胺（純度≥98.0%，德國Dr.EhrenstorferGmbH公司）；四氯蟲酰胺（純度95.5%，中化農化有限公司）；乙腈、甲醇、乙酸銨（色譜純，德國Merck公司）；NaCl、無水MgSO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；十八烷基鍵合相硅膠（C18）凈化劑、乙二胺N丙基硅烷（PSA）凈化劑（AgelaTechnologies公司）；QuEChERS分散固相萃取管（15mL離心管中裝150mgPSA、900mg無水MgSO4）、QuEChERS分散固相萃取管（15mL離心管中裝150mgC18、900mg無水MgSO4）、QuEChERS分散固相萃取管（15mL離心管中裝150mgPSA、45mg石墨炭黑（Carb）粉末、855mg無水MgSO4）；QuEChERS分散固相萃取管（15mL離心管中裝150mgPSA、150mgC18和900mg無水MgSO4，美國Agilent公司）。黃瓜、蘋果和洋蔥等實際樣品均購于本地市場。

2.2標準溶液的配制

準確稱取適量雙三氟蟲脲、氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺標準品，分別用乙腈配制成濃度為1.0mg/mL的標準儲備液；準確吸取適量上述3種農藥的標準儲備溶液，用乙腈配制成濃度為10μg/mL的標準中間溶液；準確移取上述標準中間液，以乙腈逐級稀釋，得到0.5，1，2，5，10，20，50和100μg/L系列純溶劑標準工作溶液；取空白樣品按樣品前處理過程進行處理，得到空白基質提取凈化液，用此基質溶液稀釋標準中間液，配制成適當濃度的標準工作液。

2.3樣品處理

取試樣可食用部分，粉碎并混合均勻，準確稱取10.00g（精確至0.01g），加入20mL乙腈，均質提取1min，加入4g無水MgSO4、1gNaCl，立即渦旋混勻后，7000r/min離心5min。吸取2.0mL上層有機相轉移至裝有100mgC18、50mgPSA和300mg無水MgSO4粉末的離心管中，立即渦旋混勻2min，7000r/min離心5min，取上清液過0.22μm濾膜，待LCMS/MS測定。

2.4液相色譜質譜條件

2.4.1色譜條件色譜柱：EclipseplusC18柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流動相A：乙腈，流動相B：5mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序：0～0.5min，5%A；0.5～2.0min，5%～95%A；2.0～3.5min，95%A；5.5～5.6min，95%～5%A；5.6～8.0min，5%A。流速：0.2mL/min；進樣體積：10μL；柱溫：30℃。

2.4.2質譜條件電噴霧離子源（ESI）；負離子和正離子同時掃描，氰蟲酰胺采用正離子掃描，雙三氟蟲脲和四氯蟲酰胺采用負離子掃描；多反應監測（MRM）模式；霧化器壓力：275.9kPa；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：6.0L/min；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：10.0L/min；毛細管電壓：

3500V和+3500V；監測離子對、毛細管出口電壓/碎裂電壓和碰撞能量等質譜采集參數見表1。

3結果與討論

3.1儀器條件的確定

3.1.1質譜條件的優化采用1mg/L待測化合物標準溶液，分別在正離子（ESI+）和負離子（ESI

）模式下進行全掃描（SCAN模式），雙三氟蟲脲和四氯蟲酰胺在ESI

模式下響應更高，氰蟲酰胺在ESI+模式下響應更高，因此選擇采用正負離子同時掃描方式，并確定了氰蟲酰胺、四氯蟲酰胺和雙三氟蟲脲母離子分別為m/z475.0，m/z535.8和m/z445.0。其它優化后的質譜參數見表1。

3.1.2色譜條件的優化

當采用甲醇作為有機流動相時，雙三氟蟲脲響應值大大降低，而流動相中存在甲酸時會抑制負離子電離，因此選擇使用乙腈和5mmol/L乙酸銨為流動相。采用不同比例的流動相等度洗脫時，待測農藥的靈敏度和重復性均不理想，因此采用梯度洗脫程序。比較不同的色譜柱，采用EclipseplusC18柱分析時，待測農藥保留時間以及峰形均比較理想。在優化后的色譜質譜條件下，在黃瓜、蘋果和洋蔥混合空白樣品中進行3種殺蟲劑加標回收實驗，同時包括定量離子和定性離子的MRM色譜圖如圖1所示，樣品基質不干擾3種殺蟲劑的測定。

3.2樣品前處理條件的確定

3.2.1提取溶劑的選擇進行QuEChERS前處理方法時，常加入乙酸等試劑以改善回收率[21，22]。但加入酸性溶液會影響PSA的凈化效果，本研究中雙三氟蟲脲、氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺對酸和堿都不敏感，為使PSA達到最佳凈化效果，選擇乙腈作為提取溶劑。

3.2.2基質分散凈化劑的選擇基質分散凈化常用的凈化劑有乙二胺N丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅膠鍵合相（C18）、石墨化炭黑（Carb）[23]，在去除雜質的同時也可能對目標化合物產生吸附。

分別將6mL20μg/L雙三氟蟲脲、氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺混合溶劑標2準溶液和陰性黃瓜基質標準溶液，經裝有不同種類凈化劑的4種QuEChERS分散固相萃取管進行渦旋凈化處理，回收率結果見表2。

由表2可見，使用純溶劑標準溶液進行吸附實驗時，氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺經PSA、PSA+C18和PSA+Carb處理后，回收率僅為15.1%～62.6%，而C18對氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺無吸附作用，可見，PSA對氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺產生了很強的吸附；但使用黃瓜基質標準溶劑進行同樣的吸附試驗時，PSA和C18對這3種殺蟲劑均未產生吸附作用，這可能是因為PSA吸附劑上存在很多活性位點，吸附了待測物；使用基質標準進行試驗時，吸附劑上的活性位點被基質占據，對待測農藥吸附作用減小。本研究選擇使用PSA和C18作為基質分散固相萃取劑，通過優化，選擇在每毫升提取液中加入25mgPSA和50mgC18進行基質固相分散凈化。

3.3樣品基質效應的考察

采用2.3節方法，獲得以同比例混合的、不含待測農藥的黃瓜、蘋果和洋蔥混合空白基質溶液，將此溶液經上述基質分散固相萃取凈化管（即C18、PSA、PSA+C18和PSA+Carb基質分散提取凈化劑）凈化處理，分別用乙腈和4種凈化處理后的凈化液配制系列標準溶液，進樣后得到各自的基質標準曲線。基質效應=基質匹配校準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率，斜率比越接近1，則基質效應越小[24]，具體結果見表3。從表3可知，氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺標準溶液的基質減弱效應很大，雙三氟蟲脲的基質效應較弱；使用PSA+C18作為基質分散固相萃取劑時，3種農藥的基質減弱效應均最小，但其中氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺的基質減弱效應仍較強。

同時，對不含待測農藥的蘋果、菠菜和經微波處理的洋蔥樣品，經PSA+C18基質分散固相萃取處理，對得到的相應基質標準曲線和基質效應進行了考察，結果見表4。

對比表4和表3結果，即使經PSA+C18凈化處理，除雙三氟蟲脲外，只要含有洋蔥基質的樣品溶液均存在較強的基質效應，而洋蔥經微波處理后基質減弱效應得到了很大改善。另外發現，除菠菜基質中氰蟲酰胺基質減弱效應較強外，其余基質效應均較弱。這可能是因為菠菜樣品的色素含量很高的原因。雙三氟蟲脲和四氯蟲酰胺均采用ESI

進行檢測，但雙三氟蟲脲受基質影響很小，四氯蟲酰胺則受基質

影響較大，基質效應不一致。通過上述實驗可知，基質效應主要受樣品基質、化合物性質和離子源監測模式因素的影響，應進行實際實驗明確具體農藥在多種基質下的實際基質效應。為消除樣品基質效應，本研究選擇以空白樣品提取凈化液配制基質標準溶液。實際樣品的雙三氟蟲脲添加回收實驗表明，分別采用純溶劑標準溶液和基質匹配標準溶液進行外標法定量時，檢測結果無明顯差異。另外，蔥蒜類樣品使用微波處理后可降低雜質干擾，減輕基質效應，但通過上述實驗可知，即使使用微波處理洋蔥，氰蟲酰胺仍存在較強的基質效應，而微波操作影響因素也較復雜，因此，本研究不使用微波處理進行樣品前處理。

3.4方法的線性范圍、檢出限和定量限

在優化的色譜條件和質譜條件下測定2.2節配制的系列標準工作溶液，以峰面積為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x），繪制校準曲線，3種殺蟲劑在蘋果、菠菜單基質溶液的線性方程見表4，在蘋果和洋蔥混合基質溶液中的線性方程見表3（PSA+C18），相關系數均大于0.9990，氰蟲酰胺、四氯蟲酰胺和雙三氟蟲脲在0.2～100μg/L范圍內具有良好的線性關系。以信噪比S/N=3確定檢出限（LOD），S/N=10確定定量限（LOQ），氰蟲酰胺、四氯蟲酰胺和雙三氟蟲脲在蘋果和洋蔥混合基質中的檢出限分別為0.064、0.048和0.001μg/kg，定量限分別為0.210、0.160和0.004μg/kg。

3.5回收率和精密度

對市售的蘋果、葡萄、洋蔥和菠菜樣品按照2.3節進行處理再檢測，以未檢出3種殺蟲劑的的上述樣品進行添加回收實驗。在10g粉碎樣品中分別添加0.005、0.01、0.1mg/kg和2.0mg/kg濃度水平的混合標準溶液，進行含量測定，結果見表5。3種殺蟲劑在蘋果、葡萄、洋蔥和菠菜中添加回收率在79.8%～99.9%之間，相對標準偏差（RSD）在3.6%～9.8%之間。

3.6實際樣品檢測

按照本方法對市售菠菜、甘藍、草莓、蘋果、小蔥等23批農貿市場銷售的蔬菜和水果進行雙三氟蟲脲、氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺的檢測，在兩批甘藍中檢出四氯蟲酰胺，殘留量分別0.018和0.023mg/kg。

4結論

本研究在優化樣品前處理條件和儀器條件的基礎上，建立了液相色譜串聯質譜法測定蔬菜和水果中雙三氟蟲脲、氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺殘留量的檢測方法。本方法采用改良QuEChERS方法進行樣品前處理，操作簡便快捷，樣品凈化液經LCMS/MS分析后，氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺采用基質匹配標準溶液外標法定量、雙三氟蟲脲采用基質匹配標準溶液或純溶劑標準溶液外標法定量，結果準確可靠，用于蔬菜和水果中3種殺蟲劑殘留量的檢測分析，結果令人滿意。

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AbstractAliquidchromatographytandemmassspectrometric（LCMS/MS）methodwasdevelopedforthedeterminationofbistrifluron，cyantraniliproleandSYP9080residuesinfruitsandvegetables.Theanalyteswereextractedfromsampleswithacetonitrile，andpurifiedbydispersionsolidphaseextractionusingC18andprimarysecondaryamine（PSA）assolidphaseadsorbent，thenanalyzedbyLCMS/MS.BistrifluronandSYP9080wereanalyzedwithnegativeionmultiplereactionmonitoring（MRM），cyantraniliprolewasanalyzedwithpositiveionMRM.ThematrixinducedweakeningeffectwasobservedintheanalysisofcyantraniliproleandSYP9080inseveralsamplesincludingcucumber，appleandonion，andtheweakeningextentofthematrixinducedeffectdependedonthesampleproperties.Butnomatrixeffectwasfoundintheanalysisofbistrifluroninseveralsamples.TheinterferenceofmatrixwasreducedbyusingthematrixmatchedcalibrationstandardscurveintheanalysisofcyantraniliproleandSYP9080.Bistrifluroncouldbequantifiedbyanexternalstandardofthematrixmatchedcalibrationstandardsorthepuresolventcalibrationstandards.Thelinearrangewasfrom0.2μg/Lto100μg/Lforbistrifluron，cyantraniliproleandSYP9080withthegoodcorrelationcoefficients（r≥0.9990）.Therecoveriesofcucumber，grape，appleandscallionaddedbistrifluronat0.005-2mg/kgwere79.8%-99.9%，withrelativestandarddeviations（RSD）of3.6%-9.8%.Thelimitsofquantification（S/N=10）were0.210μg/kg，0.160μg/kgand0.004μg/kg，andlimitsofdetection（S/N=3）were0.064μg/kg，0.048μg/kgand0.001μg/kgforbistrifluron，cyantraniliproleandSYP9080，respectively.

KeywordsLiquidchromatographytandemmassspectrometry；Fruitsandvegetables；Residues；Bistrifluron；SYP9080；Cyantraniliprole

（Received29June2016；accepted4January2017）