黃芪黃酮干預脾虛水濕不化大鼠血漿代謝組學研究

劉阿娜 趙文曉 鞏麗麗 于瑞雪 崔寧 陳邇東

摘要采用高效液相色譜結合飛行時間質譜檢測正常大鼠、脾虛水濕不化證大鼠及黃芪黃酮組分干預后大鼠血漿內源性代謝物變化，獲取大鼠血漿代謝圖譜，研究黃芪黃酮組分干預脾虛水濕不化證的作用機制。采用高脂低蛋白飲食加負重游泳力竭建立脾虛水濕不化證大鼠模型，選擇HaloC18色譜柱，流動相為0.05%甲酸水與0.05%甲酸乙腈，梯度洗脫，利用液相色譜串聯質譜分析測定大鼠血漿樣品。利用主成分分析法對造模前后大鼠血漿樣本進行代謝輪廓分析，結合變量投影重要性及顯著性分析等篩選對分組貢獻最大的差異標志物及相關通路，闡明藥物的作用機制。結果表明，黃芪黃酮組代謝輪廓異于模型組，而接近于正常組，共鑒定出了包含甘油磷脂類、鞘酯類、氨基酸類等在內的11種潛在生物標志物，其代謝通路包括三羧酸循環、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝及氨基酸代謝等，主要涉及體內能量代謝和脂肪代謝。黃芪黃酮干預脾虛水濕不化證大鼠后，宏觀指標（如體重、自主活動）和微觀指標（如代謝標志物、血脂）均明顯回調，表明黃芪黃酮可能主要通過調節能量代謝、脂肪代謝等途徑而發揮健脾利水作用。

關鍵詞黃芪黃酮；脾虛水濕不化證；代謝組學；高效液相色譜飛行時間質譜

1引言

黃芪為臨床傳統用藥，始載于《神農本草經》，具有健脾補中，利水消腫等功效[1]。脾虛證是一組能比較集中反映脾各種生理功能不足表現的綜合征候群，臨床多采用益氣健脾法治療。黃芪為“補益脾氣之要藥”，故在臨床上主要用于治療脾虛發熱[2]、脾虛腸易激綜合征[3]及其它各種脾虛疾病[4]，但目前其藥效的物質基礎及作用機制尚不明確。

黃芪化學成分多而復雜，主要包括皂苷、黃酮及多糖類。近代藥理研究結果表明，黃芪黃酮具有改善胃腸功能[5]促進水液代謝[6]、降低血脂、健脾[7]及抗腫瘤[8]等功效。本課題組前期研究結果也表明黃芪黃酮組分對脾虛水濕不化證大鼠一般狀況、血脂等指標均有不同程度的治療作用[9]，表明黃芪黃酮組分可能是黃芪發揮健脾利水作用的物質基礎。

目前，文獻報道的黃芪及其主要活性成分治療疾病作用機制的研究幾乎都是從藥理作用及分子角度出發。近年來，隨著代謝組學的快速發展[10～13]，越來越多的研究采用代謝組學方法闡釋中藥及復方藥治療脾虛證的機制。陳磊等[14]利用代謝組學方法研究了補中益氣湯治療脾虛的作用機制。但目前尚無從黃芪黃酮等活性成分角度對治療脾虛水濕不化證的作用機制進行研究的代謝組學研究報道。本研究從代謝組學角度出發，利用高效液相色譜飛行時間質譜結合模式識別技術分析鑒定了黃芪黃酮組分干預前后脾虛水濕不化證大鼠血漿內源性代謝物，初步探討黃芪黃酮組分治療脾虛水濕不化證的作用機制，為進一步研究黃芪健脾利水的物質基礎及深入探尋其作用機制提供科學依據。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜（美國AgilentTechnologies公司），配有在線真空脫氣機、四元泵、柱溫箱和檢測器；Agilent6230飛行時間質譜儀（美國AgilentTechnologies公司），配有ESI離子源和在線MassHunter數據采集處理系統；VORTEXGENIE2渦旋儀（美國SI公司）；凱特TD5A離心機（鹽城凱特實驗儀器有限公司）。乙腈、甲醇（色譜純，美國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國Tedia公司）；實驗用水為超純水，由美國Millipore公司的MilliQ系統制得。

2.2實驗動物

健康Wistar大鼠30只，體重（150±20）g，雌雄各半，購自魯抗醫藥集團股份有限公司實驗動物中心（許可證編號SCXK魯20130001）。

2.3實驗藥物

黃芪黃酮組分制法及含量測定：采用傳統水煎煮法，濃縮液經80%乙醇沉淀，取上清液回收至無醇味，乙酸乙酯萃取，制備黃芪黃酮組分。HPLCPDA含量測定，色譜柱為ZORBAXSBC18柱（250mm×4.6mm，5μm，美國Agilent公司）；流動相A：乙腈，B：0.1%甲酸，流速：0.5mL/min，線性梯度洗脫：0～10min，5%A；10～30min，5%～40%A；30～60min，40%～70%A；60～70min，70%～100%A。進樣量：10μL，PDA檢測波長：254nm。結果測得毛蕊異黃酮含量7.78mg/g，毛蕊異黃酮苷含量4.88mg/g，芒柄花苷含量3.80mg/g，芒柄花素含量4.79mg/g。

2.4大鼠造模方法，評價指標及分組給藥

Wistar大鼠適應性飼養1周，隨機分為正常組（10只，雌雄各半）和實驗組（20只，雌雄各半）。正常組以純化飼料飼養，實驗組依據《中藥治療脾虛證的臨床研究指標原則》和《中醫濕病學》[15，16]釆用“飲食失節（高脂低蛋白飲食）+勞倦過度（負重游泳）”復合因素誘導，建立脾虛水濕不化證大鼠模型，按毛色、體重消瘦、自主活動等指標評分，評價模型。造模成功[6]后將實驗組隨機分為模型組與黃芪黃酮組（每組各10只，雌雄各半），黃芪黃酮組根據2015版藥典成人日服黃芪最高劑量（30g/70Kg）及等效劑量系數折算法換算[17]，給予大鼠黃芪黃酮提取物0.07g/kg，正常組與模型組給予等量生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續2周。實驗過程中各組老鼠出現死亡（正常組1只（雄性），模型組2只（1雄1雌），黃芪黃酮組2只（2雌）），造模結束后25只老鼠納入代謝組學實驗用。

2.5血漿樣品的采集與處理

大鼠行腹腔麻醉，腹主動脈取血，肝素鈉抗凝，離心15min，上清液于 80℃保存。分析前血漿樣本室溫解凍，準確吸取300μL，加入600μL甲醇，渦旋1.5min，4000r/min離心15min，上清液經0.22μm微孔濾膜過濾后分析。

2.6實驗方法

2.6.1色譜條件色譜柱為HaloC18柱（100mm×2.1mm，2.7μm，美國AdvancedMaterialsTechonology公司），經色譜條件優化，流動相A為0.05%甲酸，B為0.05%甲酸乙腈。梯度洗脫：0～10min，90%～70%A；10～20min，70%～40%A；20～28min，40%A；28～30min，40%～36%A。進樣量5μL，流動相流速為0.3mL/min，柱溫25℃。

2.6.2質譜條件采用ESI源，正離子模式，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10L/min，毛細管電壓4000V，霧化氣壓力為35psi，碎裂電壓140V，質荷比掃描范圍：m/z50～1000。選取m/z121.050873和922.009798作為參比離子。

2.7代謝組學數據處理與分析

2.7.1數據質量評價所有血漿樣本取100μL，等量混合，制成質控（Qualitycontrol，QC）樣本，處理方法同血漿樣品。樣品檢測前進樣5次QC樣本，使系統平衡。每隔6個樣品插入一個QC樣本進行檢測，將獲得的QC樣本數據矩陣進行數據分析，觀察QC樣品聚類效果從而評估數據質量。

2.7.2數據處理原始質譜數據采用ProteoWizard（http：//proteowizard.sourceforge.net/）軟件轉換成“.mzXML”格式，利用XCMS處理軟件進行峰識別、峰校準、濾噪和數據簡化處理。將包含化合物保留時間、質荷比信息與峰強度的結果以“.csv”格式導入Metaboanalyst3.0（http：//www.metaboanalyst.ca）網絡分析平臺進行主成分分析（Principalcomponentsanalysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（Partialleastsquaresdiscriminantanalysis，PLSDA），用各組變量投影重要性參數（Variableimportancefortheprojection，VIP）篩選潛在的生物標志物，篩選出VIP>1[18]的變量以xls格式導入到MassProfilerProfessional軟件（美國Agilent公司，MPP）中進行AnalysisofVariance（ANOVA）分析，篩選p<0.05的變量。本實驗將VIP>1、p<0.05的代謝物作為候選的潛在生物標志物。通過檢索HMDB（http：//www.hmdb.ca）、METLIN（https：//metlin.scripps.edu）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）數據庫，同時參照文獻及質譜鑒定結果而確定標志物結構。

3結果與討論

3.1一般狀況

正常組大鼠反應敏捷，體肌健壯，攝食正常。

模型組大鼠與正常組相比表現出自主活動降低（p<0.01）、皮毛干枯、蓬亂、光澤度降低、體重下降（p<0.01）等狀況，

表明造模成功。而與模型組相比，黃芪黃酮組大鼠神倦乏力、體重（p<0.01）、自主活動（p<0.01）等能量代謝宏觀指標均有改善，表明黃芪黃酮組分對脾虛水濕不化證有一定的治療作用。

3.2血漿樣品的分離與分析

圖1為各組大鼠及QC樣本正離子模式下的總離子流圖，各組色譜峰保留時間基本一致，同一時間色譜峰高度有差別，表明3組大鼠體內的代謝模式發生變化。但圖中某些色譜峰的保留時間發生漂移，需要進行數據預處理。

3.3數據質量評價

QC實驗數據導入MetaboAnalyst3.0軟件進行主成分分析，QC數據間聚類緊密，并集中分布于95%可信區間內，表明數據質量可靠。為進一步驗證數據質量的可靠性，從QC樣本中選取質量數從低到高的10個離子（離子信號用m/z與保留時間（min）表示，計算結果顯示各離子的RSD值<3%）見表1，說明數據可靠。

3.4數據結果分析

無監督PCA方法對正常組與模型組大鼠之間的差異進行統計學分析。PCA得分圖（圖2A）中模型組與正常組明顯分離，表明兩組大鼠血漿代謝模式發生變化。為進一步尋找3組之間的差異變量，利用PLSDA進行有監督的模式識別，PLSDA得分圖（圖2B）中3組組內聚類緊密，組間區分良好，黃芪黃酮組位于兩組之間且趨向于正常組，表明給予黃芪黃酮組分后，脾虛水濕不化證大鼠血漿代謝模式趨向正常。為增加結果準確性、評判模型的有效性以及防止過度擬合現象，對PLSDA模型進行排列檢驗，結果見圖2C。在建立的模型中，原始值R2Y=0.949，Q2=0.872，說明模型的擬合能力和預測能力良好（R2Y表示模型的擬合能力，Q2表示模型的預測能力），50次隨機排列后R2和Q2的截距為0.225，-0.378（排列檢驗對應的R2和Q2的截距應各小于0.3，0.05[19]），R2和Q2兩者皆在規定范圍內，表明所建模型無過度擬合。

〖PS07402.eps，BP#〖TS（〖HK38〖HT5”SS

圖2（A）正常組、模型組PCA得分圖；（B）3組PLSDA得分圖；（C）代謝組學模型排列檢驗法的可靠性驗證結果

3.5潛在標志物的鑒定

查詢HMDB，METLIN和KEGG數據庫，并與質譜圖數據及文獻＼[20～22＼]進行比對，3組共有11種內源性代謝產物具有顯著性差異（p<0.05），見表2。與正常組相比，模型組中乳酸、磷脂酰膽堿、〖CM（44溶血磷脂酰膽堿、鞘磷脂、甘油磷酸膽堿含量升高，而苯丙氨酸、甜菜堿、丙氨酸、鞘氨醇及纈氨酸含量〖CM）

模型組vs正常組，T/M：黃芪黃酮組vs模型組p<0.05，p<0.01↑上調；↓下調。

M/N：Modelgroupvsnormalgroup，T/M：flavonoidsofAstragalusgroupvsmodelgroup，p<0.05，p<0.01↑up；↓down.[BG）W][HT5][HJ]

下降（p<0.05，p<0.01）；黃芪黃酮組與模型組相比11種內源性代謝物含量發生不同程度的回調（圖3），表明黃芪黃酮組分對脾虛水濕不化證有一定的治療作用。實驗鑒別出的代謝產物，聯系其相關的代謝通路，構建了相關代謝網絡示意圖。

3.6標記物代謝通路分析

脾虛水濕不化證模型大鼠血漿中乳酸含量升高，見圖3F。乳酸在機體內的代謝途徑大致有兩條：一是完全氧化為CO2和H2O供能，二是通過糖異生途徑轉化為葡萄糖，上述兩條代謝途徑皆需要氧氣[23]。本實驗模型組中乳酸含量顯著高于正常組，可能是由于對氧的利用率下降所致。陳磊等[14]研究發現乳酸在脾虛證模型大鼠脾臟中也具有同樣的變化趨勢。黃芪黃酮組分干預后大鼠血中乳酸含量下調，表明黃芪黃酮組分可能通過糾正低氧狀態而發揮治療作用。

苯丙氨酸、纈氨酸及丙氨酸皆為生糖氨基酸。在體內酶的作用下纈氨酸分解產生琥珀酰輔酶A。苯丙氨酸在酶的作用下先生成酪氨酸，后者體內繼續分解代謝最終形成乙酰乙酸和延胡索酸，丙氨酸參與體內丙氨酸葡萄糖循環途徑，在脫氨酶的作用下生成丙酮酸，亦可轉化為葡萄糖儲存能量[23]。相關代謝物的代謝網絡示意圖如圖4所示，3種氨基酸的代謝產物為三羧酸循環代謝底物。本實驗模型組大鼠體內3種氨基酸含量下調（見圖3H，J和K），表明脾虛大鼠體內氨基酸代謝紊亂而間接導致能量代謝功能下降[22]，黃芪黃酮組分干預后，3種氨基酸水平回調，表明黃芪黃酮組分干預脾虛水濕不化過程中通過調節體內氨基酸水平而間接調控三羧酸代謝發揮治療作用。

溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、甘油磷脂酰膽堿三者皆屬于膽堿類化合物。三者在體內能夠促進脂肪燃燒[24]。實驗過程中，高脂低蛋白飲食造成大鼠脾虛證候，致飲食減少[6]，糖攝入及運化不足，導致糖分解供能障礙。機體為維持基本生命活動，代償性動員脂肪分解供能[24]，脂肪分解供能過程中體內上述膽堿類物質含量上調（見圖3A，B和E），但過度動員導致體內脂肪代謝紊亂[24]。楊宇峰等[21]在利用代謝組學研究脾腎氣虛證時發現，患者血漿中溶血磷2脂酰膽堿與正常組相比有上調的趨勢，與本研究結果一致。黃芪黃酮組分干預后，大鼠脾虛癥狀緩解，飲食增加，能量代謝恢復，不再代償性分解脂肪。膽堿類物質在干預后下調，表明黃芪黃酮組分通過健脾利水作用，恢復能量代謝而使脂肪代謝恢復正常。

棕櫚酰肉堿（圖3D），體內長鏈脂酰CoA與肉毒堿結合轉化為脂酰肉毒堿（如棕櫚酰肉堿）進入線粒體內膜，實現脂肪酸在線粒體內進行β氧化，為機體供能[25]。甜菜堿（圖3I），體內可由膽堿轉化而來[25]。甜菜堿作為一種甲基供體，可為甲基化產物肉堿提供甲基，促進肉堿合成。本實驗中模型組大鼠體內脂肪代謝活躍，導致肉堿含量被動增加，故棕櫚酰肉堿含量升高，而甲基供體的甜菜堿含量下調。這可能與脾虛導致的運化水谷精微減少相關，體內代償性分解脂肪，故棕櫚酰肉堿含量升高，而甜菜堿含量下調[26]。黃芪黃酮組分干預后，糖代謝恢復正常，脂肪動員減弱，棕櫚酰肉堿在大鼠體內含量下調，而甜菜堿含量上調。

綜上所述，脾虛水濕不化證大鼠代謝組學研究表明，疾病大鼠體內能量代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝等微觀指標代謝異常，這與前期疾病大鼠體重、自主活動等宏觀指標研究結果相符[9]。黃芪黃酮組分可能通過調節上述代謝通路發揮健脾利水作用，使脾虛水濕不化證大鼠宏觀指標恢復正常，上述代謝組學研究結果表明，黃芪黃酮組分確為黃芪藥材健脾利水的藥效成份之一。

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AbstractAmethodofhighperformanceliquidchromatographycoupledwithtimeofflightmassspectrometrywasusedtodetecttheendogenousmetaboliteschangesinplasmaofnormalrats，ratsofdampnessstagnancyduetospleendeficiencyandAstragalusflavonecomponentinterventionrats.MetabolismmapofratplasmawasobtainedandthemechanismofAstragalusflavonoidsondampnessstagnancyduetospleendeficiencywasstudied.Ratmodelwithdampnessstagnancyduetospleendeficiencywasestablishedbyhighfatandlowproteindietplusloadswimming.Liquidchromatographytandemmassspectrometrywasusedfortheanalysisofratplasmasample，and0.05%formicacidwaterwith0.05%formicacidacetonitrileasthemobilephasewasappliedingradientelutionwithHaloC18chromatographiccolumn.Inthisstudy，partialleastsquaresdiscriminantanalysisandvarianceanalysiswereusedtoscreenthepotentialbiomarkers，itwasfoundthatthemetabolicprofileoftheAstragalusflavonoidswasdifferentfromthatofthemodelgroup，whichwasclosetothatofthenormalgroup.Atotalof11potentialbiomarkerswereidentified，includingglycerolphospholipids，sphingolipids，aminoacids，andsoon.Themetabolicpathwaysofbiomarkersincludingthreetricarboxylicacidcycle，glycerolphospholipidmetabolism，fattyacidmetabolism，aminoacidmetabolismandsoon，whichmainlyrelatedtoenergymetabolismandfatmetabolisminthebody.RelatedindexesofratswithsyndromeofspleendeficiencyofwateranddampnessweresignificantlycallbackafterAstragalusflavoneintervention，includingmacroindicatorssuchasbodyweight，independentactivitiesandmicroindicatorssuchasmetabolicmarkers，bloodlipidsandothers.TheresultshowedthatAstragalusflavonoidsplayedtheroleofstrengtheningthespleenanddrainingthewatermainlythroughregulatingtheenergymetabolism，fatmetabolismandsoon.

KeywordsAstragalusflavonoids；Dampnessstagnancyduetospleendeficience；Metabolics；Highperformanceliquidchromatographytimeofflightmassspectrometry

（Received5October2016；accepted9December2016）

ThisworkweresupportedbytheNationalBasicResearchProgramofChina（Nos.2013CB5318000）.