棉花早期光誘導(dǎo)蛋白基因GhELIP1序列及表達(dá)分析

摘 要 植物早期光誘導(dǎo)蛋白（ELIP）參與到植物逆境脅迫響應(yīng)和果實(shí)成熟過程中。對(duì)棉花GhELIP1基因進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)582 bp，編碼193個(gè)氨基酸，屬于葉綠素a/b結(jié)合蛋白超家族。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，GhELIP1蛋白與棉花中的其他4個(gè)ELIP蛋白親緣關(guān)系最近，其次是可可。表達(dá)分析表明，GhELIP1基因在衰老葉片中的表達(dá)量最高，表明GhELIP1基因參與棉花葉片的衰老調(diào)控。該研究結(jié)果可為在棉花中進(jìn)一步闡明GhELIP1基因的功能奠定基礎(chǔ)，為棉花生物技術(shù)和分子育種提供優(yōu)異的基因資源。

關(guān)鍵詞 棉花；GhELIP1基因；序列；表達(dá)

中圖分類號(hào)：S562；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.25.009

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20170908.1510.018.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017/9/8 15：10：57

綠色植物中，葉綠素和類胡蘿卜素結(jié)合在光系統(tǒng)中各種相關(guān)蛋白上捕獲光能量。葉綠素結(jié)合蛋白有2種類型，第一類只結(jié)合葉綠素a，第二類既結(jié)合葉綠素a也結(jié)合葉綠素b。其中，第二類的葉綠素結(jié)合蛋白即為核基因編碼的色素結(jié)合的集光復(fù)合體蛋白（light-harvesting complex，LHC）[1]。LHC家族蛋白由30多種不同成員組成，早期光誘導(dǎo)蛋白（early light-induced proteins， ELIPs）就是其中一種[2]。

ELIP蛋白最初是在豌豆中鑒定到的，它在黃化豌豆苗去黃化的早期被誘導(dǎo)表達(dá)，在葉綠體發(fā)育完全后停止表達(dá)[3]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，如今ELIP蛋白已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、楊樹（Populus L.）、苜蓿（Medicago L.）、茶樹（Camellia sinensis）等多種植物中被鑒定[2]。ELIP蛋白有3個(gè)跨膜的α螺旋，其中螺旋Ⅰ和Ⅲ高度相似，分別對(duì)應(yīng)LHCⅠ和LHCⅡ的相應(yīng)區(qū)域。ELIP蛋白中的保守殘基對(duì)于葉綠素a結(jié)合在LHC復(fù)合體上非常重要，目前已發(fā)現(xiàn)ELIP蛋白至少可以結(jié)合在4種葉綠素a分子上。LHC和ELIP的主要區(qū)別在于，ELIP蛋白只在發(fā)育的質(zhì)體膜或?qū)⒊墒烊~片暴露在強(qiáng)光照下時(shí)瞬時(shí)表達(dá)。在強(qiáng)光照脅迫和一些其他環(huán)境脅迫（如寒冷、干旱、高溫等）下， ELIP也會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。此外，果實(shí)成熟也會(huì)誘導(dǎo)ELIP蛋白的合成[1， 4]。擬南芥中ELIP2的組成型表達(dá)導(dǎo)致葉綠體中葉綠素含量降低，伴隨著類囊體中光合系統(tǒng)數(shù)量的減少，而光合系統(tǒng)的功能沒有明顯變化；進(jìn)一步研究表明，ELIP的功能是通過抑制葉綠素合成通路，來調(diào)節(jié)類囊體中葉綠素的含量[1]。

棉花（Gossypium spp.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉花葉片發(fā)育為棉纖維發(fā)育提供養(yǎng)分，對(duì)于棉纖維發(fā)育十分重要[5]。目前未見棉花中關(guān)于ELIP基因的報(bào)道，本研究分析了一個(gè)棉花中的ELIP基因，命名為GhELIP1，對(duì)其基因序列、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行初步分析，并對(duì)其在棉花葉片發(fā)育過程中的表達(dá)模式進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)該基因隨著葉片發(fā)育表達(dá)量逐漸升高。研究目的旨在為棉花中進(jìn)一步闡明GhELIP1基因的功能奠定基礎(chǔ)，為棉花生物技術(shù)和分子育種提供優(yōu)異的基因資源。

1材料與方法

1.1GhELIP1序列的獲得和生物信息學(xué)分析

由于棉花基因組數(shù)據(jù)已測(cè)序，預(yù)測(cè)的CDS序列也在NCBI中公布，因此從NCBI中下載GhELIP1的全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)：XP_016715826.1）。根據(jù)NCBI中的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)其氨基酸序列。利用NCBI中的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）預(yù)測(cè)GhELIP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)。利用EBI的在線網(wǎng)址（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/）進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，利用MEGA6.0構(gòu)建進(jìn)化樹[6]。

1.2實(shí)驗(yàn)材料的種植

將棉花種子泡種24 h后，選取飽滿出芽的種子種于人工氣候室，光周期為16 h光照、8 h黑暗，晝/夜溫度分別為30℃/25℃，待子葉展平后標(biāo)記為0 d，之后每隔5 d取1次樣，直到子葉完全變黃，這一過程共為40 d，總共取樣8次。每次取樣時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片至少10片，均勻混合后在液氮中速凍，然后保存于超低溫冰箱（-80℃）待用。每次取樣3個(gè)重復(fù)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用plus 植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取總RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。利用Primer premier6.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)為：片段大小50～250 bp，退火溫度 （60±2） ℃，引物長(zhǎng)度20～22 bp，GC 含量45%～55%[5]。GhELIP1上游引物序列為TCAGTTCATGAGCTCGGATG，下游引物序列為TTCCGCCCTTTACATATTCG。以棉花ACTIN為內(nèi)參基因（GenBank登錄號(hào)： AY305726），上游引物序列為ATCCTCCGTCTTGACCTTG，下游引物序列為TGTCCGTCAGGCAACTCAT。使用SYBR? Premix Ex TaqTM [Tli RNaseH Plus，寶生物工程（大連）有限公司]進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用2- ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)[7]。

2結(jié)果與分析

2.1GhELIP1序列分析

從NCBI上獲得該基因的全長(zhǎng)序列，如圖1所示，該基因全長(zhǎng)582 bp，由起始密碼子ATG開始，終止密碼子TAG結(jié)束。其堿基組成相對(duì)均勻：A為141個(gè)（24.22%），T為149個(gè)（25.60%），C為128個(gè)（21.99%），G為164個(gè)（28.18%）。編碼的蛋白全長(zhǎng)193 aa，利用保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫對(duì)該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于葉綠素a/b結(jié)合蛋白超家族（e_value為7.26e-8），從氨基酸第94位到186位是該家族蛋白結(jié)構(gòu)上都具有的3個(gè)跨膜α螺旋（圖2）。因此說明棉花GhELIP1與其他物種中ELIP蛋白一樣，均屬于葉綠素a/b結(jié)合蛋白超家族。

2.2GhELIP1進(jìn)化關(guān)系分析

通過在NR庫中進(jìn)行BLASTP的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)陸地棉（G. hirsutum）、亞洲棉（G. arboretum）和雷蒙德氏棉（G. raimondii）中共含有5條ELIP蛋白，其中陸地棉中2條（XP_016715826.1和XP_016715301.1），雷蒙德氏棉中1條（XP_012487200.1），亞洲棉中2條（XP_017605022.1和KHG26201.1）。將5個(gè)棉花ELIP蛋白、除棉花外與GhELIP1最為同源的可可（Theobroma cacao）ELIP蛋白和擬南芥中已知的兩個(gè)ELIP蛋白進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)8個(gè)ELIP蛋白都含有葉綠素a/b結(jié)合蛋白超家族的保守域，在這一保守域內(nèi)絕大多數(shù)的氨基酸都是一致的，5個(gè)棉花中的ELIP蛋白保守域外的氨基酸序列也相對(duì)保守（圖2）。將這8條氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明：5條棉花中的ELIP蛋白親緣關(guān)系最近，聚為一類；可可與棉花ELIP蛋白親緣關(guān)系也較近，聚在一起；擬南芥2個(gè)ELIP蛋白聚在一起，與棉花ELIP蛋白的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3）。

2.3GhELIP1在棉花葉片發(fā)育過程中的表達(dá)過程分析

將葉片按照生長(zhǎng)過程分成8個(gè)時(shí)期，其中第35天時(shí)葉片變?yōu)辄S綠色，第40天時(shí)徹底變黃。利用qRT-PCR檢測(cè)了GhELIP1基因在棉花葉片發(fā)育過程中的表達(dá)情況，如圖4所示，該基因在30 d之前的葉片中表達(dá)量極低，到35 d時(shí)表達(dá)量顯著升高，40 d繼續(xù)升高。表明GhELIP1基因在衰老的葉片中上調(diào)表達(dá)，而在成熟葉片中表達(dá)量較低。

3討論

陸地棉是最重要的栽培棉，屬于異源四倍體，亞洲棉和雷蒙德氏棉是陸地棉的祖先種，通過系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，5個(gè)棉屬中ELIP蛋白聚在一起，本研究的GhELIP1與雷蒙德氏棉中XP_012487200.1的親緣關(guān)系更近，表明GhELIP1可能來自于雷蒙德氏棉，而另一個(gè)陸地棉中的ELIP蛋白（XP_016715301.1）則與亞洲棉的2條ELIP蛋白（XP_017605022.1和KHG26201.1）聚在一起，表明XP_016715301.1來自于亞洲棉。通過雷蒙德氏棉基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)棉花與可可基因組存在大量同源片段，二者的親緣關(guān)系最近[8]，本研究發(fā)現(xiàn)5條棉花中的ELIP蛋白與可可ELIP蛋白（EOY05794.1）聚在一起，也證實(shí)了這一結(jié)論。

目前ELIP蛋白已經(jīng)在多個(gè)物種中被鑒定，其主要功能集中在抗逆。從齒肋赤蘚體內(nèi)獲得6條含有完整ORF的ELIP基因，篩選了2條對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)鹽脅迫、冷脅迫、紫外脅迫、藍(lán)光和紅光兩種強(qiáng)光脅迫都有響應(yīng)，表明這2個(gè)基因具有非生物脅迫抗性和光保護(hù)作用[9]。從怪柳中克隆到一個(gè)ELIP基因，轉(zhuǎn)化到煙草后植株耐鹽性顯著增加[10]。也有研究表明ELIP基因參與果實(shí)的成熟，將西紅柿從幼嫩果實(shí)到成熟分為7個(gè)時(shí)期，前4個(gè)時(shí)期西紅柿為青綠色，果實(shí)逐漸增大，第4個(gè)時(shí)期達(dá)到最大，第5個(gè)時(shí)期開始西紅柿明顯變黃，第6個(gè)時(shí)期以后變紅，第7個(gè)時(shí)期完全成熟，ELIP基因的表達(dá)在前4個(gè)時(shí)期較低，第5個(gè)時(shí)期表達(dá)量最高，第6、7個(gè)時(shí)期表達(dá)量比第5個(gè)時(shí)期有一定程度的下降，但依然維持在一定的表達(dá)水平[4]。本研究發(fā)現(xiàn)GhELIP1基因在棉花衰老葉片中上調(diào)表達(dá)，表明GhELIP1可能參與棉花葉片的衰老，TZVETKOVA-CHEVOLLEAU等研究表明擬南芥ELIP2蛋白能夠抑制葉綠素合成通路中的每一個(gè)步驟[1]，由此推測(cè)棉花GhELIP1基因也具有相似的功能，在衰老葉片中大量表達(dá)后，抑制葉綠素的合成，從而葉片由綠轉(zhuǎn)黃，逐漸走向衰老。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）