梓樹根皮總黃酮分離純化及其抑菌活性研究

邵金華 何福林 陳 霞 謝 雨

(湖南科技學院湖南省銀杏工程技術研究中心湘南優勢植物資源綜合利用重點實驗室，湖南 永州 425199)

梓樹根皮總黃酮分離純化及其抑菌活性研究

邵金華 何福林 陳 霞 謝 雨

(湖南科技學院湖南省銀杏工程技術研究中心湘南優勢植物資源綜合利用重點實驗室，湖南 永州 425199)

以吸附率和解析率為評價指標，用大孔樹脂對梓樹根皮總黃酮的分離純化工藝進行優化，并研究純化后梓樹根皮總黃酮的抑菌活性。結果表明，梓樹根皮總黃酮分離純化最佳工藝條件為：采用NKA-II樹脂，上樣液質量濃度0.538 mg/mL，上樣液流速1.66 mL/min，上樣液pH值4.01，洗脫劑乙醇濃度70%，洗脫流速2.5 mL/min。該條件下，梓樹根皮總黃酮純度為(77.43±0.23)%，吸附率為(93.36±0.25)%，解析率為(95.51±0.17)%。抑菌活性表明，梓樹根皮總黃酮對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌作用為極敏，對青霉菌、釀酒酵母菌抑菌作用為高敏；金黃色葡萄球菌的MIC值為(6.25±0.25) mg/mL；枯草芽孢桿菌、大腸桿菌MIC值為(12.50±0.36) mg/mL；釀酒酵母、青霉菌，MIC值為(25.00±0.27) mg/mL。

梓樹；根皮；黃酮；大孔吸附樹脂；分離純化；抗菌活性

梓樹 (CatalpaovataG.Don) 為紫葳科梓屬喬木植物，它的皮稱為梓皮、梓根白皮、梓白皮、土杜促、梓木白皮；樹皮的韌皮部 (名梓白皮) 或根皮可做藥用，嫩葉可食[1-2]。研究[3-6]發現，梓樹果實、葉、莖皮、根皮等部位都含有大量活性成分，如環烯醚萜類、黃酮類、生物堿等。

黃酮類化合物在保健、醫藥、食品等領域廣泛應用，是天然產物領域的研究熱點之一。黃酮類物質常用的分離純化方法有金屬試劑絡合沉淀法[7]、雙水相萃取法[8]、柱層析法[9]、高效液相色譜法[10]、膜分離法[11]、薄層層析法[12]、大孔樹脂吸附法[13]等。與其它純化方法比較，大孔樹脂吸附法具有選擇性較好、理化性質穩定、機械強度高、不溶于酸、堿及有機溶劑、比表面積較大、易于再生、交換速度較快[14]等優點，因此，其在黃酮類物質純化中被廣泛應用，效果也較好?？股氐臑E用，導致病原菌具有廣泛的耐藥性，新抗菌藥物的研發亟待解決。大量的文獻[15-17]表明，自然界從低等到高等植物各部分提取的黃酮類化合物都有較好的抑菌作用。

目前對梓樹根皮總黃酮的分離純化以及抗菌活性研究未見報道。本研究擬采用大孔樹脂吸附法對梓樹根皮中總黃酮進行分離純化，以提高粗提取物中總黃酮的純度，并研究純化后梓樹根皮總黃酮的抑菌活性，旨在為其綜合利用以及開發具有保健功能的天然抗菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料

梓樹根皮：采自湖南省永州市祁陽縣白水鎮，將梓樹根皮用毛刷刷洗干凈，再用剪刀將其剪碎，然后放入真空干燥箱中烘干至恒重，最后用植物粉碎機將其粉碎，過100 目篩，室溫保存于實驗室備用。

1.1.2 試劑

槲皮素、山奈酚，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)：中國科學院成都生物研究所菌種保藏中心；

青霉菌(Penicilliumnotatum)、釀酒酵母菌 (Saccharomycescerevisiae)：湖南科技學院微生物實驗室；

AB-8、NKA-II、X-5、D3520、D101、ADS-7大孔樹脂：天津市光復精細化工研究所；

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸鉛、鎂粉、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等：分析純，上海國藥集團化學試劑廠。

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜：LC-20A型，日本島津制作所；

電子天平：JA3003型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：R201D-II型，鄭州長城科工貿易有限公司；

酸度計：PHS-802型，貴陽學通儀器儀表有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-06型，武漢海聲達設備儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮提取液的制備 稱取1 000 g梓樹根皮干粉，以料液比為1∶10(g/mL)加入體積分數為95%的乙醇，回流提取3次，每次3 h，過濾，合并提取液，75 ℃旋轉蒸發后60 ℃真空干燥，備用。

1.2.2 梓樹根皮總黃酮含量的測定

(1) 標準品溶液配制：精密稱取槲皮素標準品3.7 mg，山奈酚標準品5.4 mg，加80%甲醇溶解并用容量瓶定容至50 mL，搖勻，即得混合標準品儲備液。

(2) 色譜條件：島津LC-20A型高效液相色譜；Shimadzu C18色譜柱(4.6 μm×250 mm，5 μm)；以體積比為1∶1的甲醇—0.4%磷酸為流動相；檢測器紫外波長為360 nm；進樣量10～20 μL；流速1.0 mL/min；柱溫箱40 ℃。

(3) 總黃酮測定：根據文獻[18]的方法，將總黃酮苷水解成為槲皮素和山奈酚，使用 HPLC 測定槲皮素和山奈酚的含量，根據式(1)計算總黃酮醇苷的含量。

m總=(m1×1.65+m2×1.74)，

(1)

式中：

m總——總黃酮苷含量，mg/L；

m1——槲皮素含量，mg/L；

m2——山奈酚含量，mg/L。

1.2.3 靜態吸附試驗 將大孔吸附樹脂AB-8、NKA-II、X-5、D3520、D101、ADS-7用乙醇浸泡24 h，然后用乙醇繼續洗滌至洗滌液加水稀釋不渾濁，用蒸餾水洗至無醇味后抽濾。精確稱取大孔樹脂各2.0 g置于干燥錐形瓶中，各加入總黃酮濃度為0.489 1 mg/mL的提取液20 mL，置于25 ℃恒溫搖床進行靜態吸附，直至吸附平衡(10 h)。吸附后，按照1.2.2方法測定溶液中總黃酮含量。分別對各吸附后的樹脂進行抽濾，并用蒸餾水洗滌3次，然后用70%乙醇溶液(35 mL)于25 ℃恒溫搖床解析10 h，按照1.2.2方法測定溶液中總黃酮含量。分別計算靜態吸附時每種大孔樹脂的吸附量和解析率。

(2)

(3)

式中：

Q——樹脂吸附量，mg/g·干樹脂；

Mr——濕樹脂質量，g；

a——樹脂含水率，%；

M——吸附前溶液中總黃酮質量，mg；

Md——吸附后溶液的總黃酮質量，mg；

W解——樹脂解析率，%；

Me——洗脫液中總黃酮質量，mg。

1.2.4 大孔樹脂動態吸附試驗 將預處理后的大孔樹脂抽濾，準確稱取樹脂各15.00 g,用蒸餾水濕法裝柱。將35 mL總黃酮濃度為0.538 mg/mL的吸附液加入層析柱，流速為1 BV/h，上樣后，先用1 BV水洗，然后用70%乙醇溶液洗脫3 BV，收集洗脫液，65 ℃真空干燥成粉末狀，按照1.2.2方法測定其中總黃酮含量。分別計算解析率、吸附率和純度。

(4)

(5)

式中：

W吸——樹脂吸附率，%；

M——上樣液中總黃酮，mg；

Md——流出液中總黃酮，mg；

P——總黃酮純度，%；

Me——洗脫液蒸干后測定總黃酮質量，mg；

M烘干——溶液烘干后質量，mg。

1.2.5 NKA-II大孔樹脂純化梓樹根皮總黃酮條件的研究

(1) 上樣液濃度：將預處理后的大孔樹脂抽濾，準確稱取樹脂各15.00 g，用蒸餾水濕法裝柱。將35 mL總黃酮濃度分別為0.302，0.538，0.893，1.285，1.594 mg/mL的吸附液加入層析柱，流速為1 BV/h，上樣后，先用1 BV水洗，然后用70%乙醇溶液洗脫3 BV，收集洗脫液，65 ℃真空干燥成粉末狀，按照1.2.2方法測定其中總黃酮含量，并計算各自的吸附率，以確定最佳上樣液濃度。

(2) 上樣液pH值：將預處理后的大孔樹脂抽濾，準確稱取樹脂各15.00 g，用蒸餾水濕法裝柱。將35 mL總黃酮濃度為0.538 mg/mL、不同pH(3.04，4.01，5.08，6.05，7.09)的吸附液加入層析柱，流速為1.5 mL/min，上樣后，先用1 BV水洗，然后用70%乙醇溶液洗脫3 BV，收集洗脫液，65 ℃真空干燥成粉末狀，按照1.2.2方法測定其中總黃酮含量，并計算各自的吸附率，以確定最佳pH。

(3) 上樣液流速：將預處理后的大孔樹脂抽濾，準確稱取樹脂各15.00 g，用蒸餾水濕法裝柱。將35 mL總黃酮濃度為0.538 mg/mL、pH 4.01的吸附液加入層析柱，流速分別為1.38，1.66，1.90，2.18，2.40 mL/min，上樣后，先用1 BV水洗，然后分別用70%乙醇水溶液洗脫3 BV，收集洗脫液，65 ℃ 真空干燥成粉末狀，按照1.2.2方法測定其中總黃酮含量，并計算各自的吸附率，以確定最佳洗脫液濃度。

(4) 洗脫劑濃度：將預處理后的大孔樹脂抽濾，準確稱取樹脂各15.00 g,用蒸餾水濕法裝柱。將35 mL總黃酮濃度為0.538 mg/mL、pH 4.01的吸附液加入層析柱，流速為1.66 mL/min，上樣后，先用1 BV水洗，然后分別用40%，50%，60%，70%，80%乙醇水溶液洗脫3 BV，收集洗脫液，65 ℃真空干燥成粉末狀，按照1.2.2方法測定其中總黃酮含量，并計算各自的解析率，以確定最佳洗脫液濃度。

(5) 洗脫劑流速：將預處理后的大孔樹脂抽濾，準確稱取樹脂各15.00 g，用蒸餾水濕法裝柱。將35 mL總黃酮濃度為0.538 mg/mL、pH 4.01的吸附液加入層析柱，上樣流速為1.66 mL/min，先用1 BV水洗，然后分別用70%乙醇水溶液洗脫3 BV，洗脫液流速分別為1.6，1.9，2.2，2.5，2.8 mL/min 收集洗脫液，65 ℃真空干燥成粉末狀，按照1.2.2 方法測定其中總黃酮含量，并計算各自的解析率，以確定最佳洗脫液濃度。

1.2.6 NKA-II大孔樹脂最佳條件分離純化梓樹根皮總黃酮

NKA-II大孔樹脂15.00 g，用蒸餾水濕法裝柱，按照最佳吸附和洗脫條件，對梓樹根皮總黃酮進行動態吸附，收集洗脫液，65 ℃真空干燥成粉末狀，按照1.2.2方法測定其中總黃酮含量，計算解析率、吸附率和純度。

1.2.7 梓樹根皮總黃酮進一步純化 取NKA-II大孔樹脂純化后的樣品2 g(旋轉蒸發、烘干后)，一定量甲醇溶解，用100～200目硅膠混勻，通風櫥揮干(備用)。稱取60 g硅膠，干法裝柱，裝于1.6 cm×400.0 mm層析柱中，干法上樣，分別用體積比為10∶1，9∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1的氯仿—甲醇溶液及純甲醇進行梯度洗脫，收集各部分洗脫液，高效液相測定其含量，合并含總黃酮高的流分，稍微濃縮，放置析晶，再重復一次硅膠柱層析，合并總黃酮含量高流分，析晶，即得到較高純度總黃酮。按照1.2.2方法測定其中總黃酮含量，經計算，總黃酮純度達到(89.59±0.19)%。

1.2.8 梓樹根皮總黃酮抗菌活性測定 將硅膠柱純化后梓樹根皮總黃酮用75%乙醇配制成8.25 mg/mL溶液備用。采用紙片擴散法[19]測定其抑菌圈直徑；最小抑菌濃度(MIC)的測定方法參照文獻[20]進行。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂對總黃酮靜態吸附

由表1可知，6種樹脂中對總黃酮的吸附效量最大的為ADS-7，其次為NKA-Ⅱ；解析率最大的為NKA-Ⅱ，最小為ADS-7；綜合考慮，靜態吸附選擇NKA-Ⅱ。

表1 不同類型大孔樹脂靜態吸附對總黃酮吸附量和解析率Table 1 Adsorption and analytical results of different types of macroporous resin

2.2 大孔樹脂對總黃酮動態吸附

為了更全面研究各種大孔樹脂對總黃酮的吸附性能，將6種大孔樹脂都進行了動態吸附試驗，結果見表2。由表2可知，6種大孔樹脂對梓樹根皮總黃酮都有不同程度純化效果，其中NKA-Ⅱ純化效果最好，經NKA-Ⅱ純化后，總黃酮純度由原來的14.16%提高到54.26%，吸附率為89.37%，解析率為90.16%。最終確定用NKA-Ⅱ大孔樹脂對梓樹根皮總黃酮進行分離純化。

2.3 NKA-Ⅱ純化梓樹根皮總黃酮條件研究

2.3.1 上樣液濃度 由圖1可知，上樣液濃度在0.302～0.538 mg/mL時，隨著樣品溶液濃度的增大，對總黃酮的吸附率增大；當上樣液濃度為0.538 mg/mL時，總黃酮吸附率達到最大值，為(93.6±0.23)%；上樣液濃度在0.538～1.594 mg/mL時，樹脂吸附率隨樣品溶液濃度的增大而減小。可能是上樣液濃度過大時會發生絮凝和沉淀，造成樹脂堵塞使吸附率降低；濃度過低時，吸附率不高又容易造成樹脂的浪費[21]。所以確定0.538 mg/mL為最佳上樣液濃度。

表2 動態吸附中大孔樹脂對黃酮吸附率、解析率及純化效果

Table 2 Adsorption rate, desorption rate and purification effect of macroporous resin in dynamic adsorption %

樹脂類型上柱前黃酮純度上柱后黃酮純度吸附率解析率AB-814.16±0.3143.27±0.3179.52±0.2886.19±0.23ADS-714.16±0.3135.60±0.1691.05±0.3248.62±0.36D10114.16±0.3149.55±0.2781.13±0.2477.35±0.27D352014.16±0.3131.51±0.3367.97±0.2963.52±0.31NKA-Ⅱ14.16±0.3154.26±0.3689.37±0.3190.16±0.33X-514.16±0.3129.59±0.3275.38±0.1981.65±0.25

不同字母表示組間差異顯著

Figure 1 Effect of different sample solution concentration on the adsorption rate of flavonoids

2.3.2 上樣液pH值 由圖2可知，樣品溶液在pH 3.04～4.01時，隨著pH值的增大，黃酮的吸附率增大；在pH 4.01時黃酮吸附率達到峰值，為(92.5±0.22)%；在pH 4.01～7.09時，黃酮吸附率隨著pH值的增大而減小。根據李淑珍等[22]的研究，一般情況下，酸性化合物在酸性條件下更容易被吸附，堿性化合物在堿性條件下更容易被吸附，而黃酮類化合物具有酚羥基結構，呈現一定的酸性，它在弱酸條件下以分子狀態存在，可以憑借范德華力和樹脂發生吸附作用，但溶液酸性太強時會有少量沉淀析出，因此確定最佳pH值為4.01。

不同字母表示組間差異顯著

Figure 2 Effect of different sample solution pH on the adsorption rate of flavonoids

2.3.3 上樣液流速 由圖3可知，上樣液流速在1.38～1.66 mL/min時，隨著流速的增大，黃酮的吸附率增大；當流速為1.66 mL/min時，黃酮吸附率達到最大值，為(91.59±0.35)%，當流速在1.66～2.4 mL/min時，隨著流速的增大，黃酮吸附率減小。趙玉芬等[23]研究表明，流速過低時溶液與樹脂的接觸時間雖長，但也會提高解吸率，適當增大流速可使吸附率提高，而流速過高時溶液與樹脂的接觸時間太短，有效成分不能完全吸附在樹脂上，從而導致黃酮的泄漏量增加，吸附率降低。因此確定1.66 mL/min為最佳上樣流速。

2.3.4 洗脫劑濃度 由圖4可知，當乙醇體積分數為40%～70%時，隨乙醇體積分數的增大解析率增大；當乙醇體積分數為70%時，解吸率達到最大值，為(95.46±0.26)%；當乙醇體積分數為70%～80%時，隨乙醇體積分數的增大解吸率下降。乙醇體積分數過低時，解吸量較低，不能將吸附的黃酮完全解吸，當乙醇體積分數為70%時解吸率最高，根據相似相溶原理可能是梓樹根皮中黃酮的極性和70%乙醇極性相似[24]，因此選擇乙醇體積分數為70%。

不同字母表示組間差異顯著

不同字母表示組間差異顯著

2.3.5 洗脫劑流速 由圖5可知，流速在1.6～2.5 mL/min時，黃酮解析率逐漸增大；流速為2.5 mL/min時，黃酮的解析率達到最高?？赡苁禽^低流速下洗脫劑能較充分地進入樹脂空隙中將吸附在樹脂表面上的黃酮溶解洗脫下來，而過高的流速使得洗脫劑尚未充分進入樹脂空隙中就流出了樹脂柱，造成黃酮類化合物未能被充分解吸[25]。因此選擇洗脫液流速為2.5 mL/min。

2.4 NKA-Ⅱ大孔樹脂最佳條件分離純化梓樹根皮總黃酮

NKA-Ⅱ大孔樹脂在最優條件下對總黃酮進行動態吸附3次，平均吸附率為(93.36±0.25)%，解析率為(95.51±0.17)%，總黃酮純度為(77.43±0.23)%。標準品、梓樹根皮總黃酮上柱前以及二次純化后HPLC圖見圖6～8。由圖6～8可知，大孔樹脂純化效果明顯。

不同字母表示組間差異顯著

圖6 槲皮素和山奈酚標準品的HPLC圖譜

Figure 6 The High Performance Liquid Chromatography of quercetin and kaempferol standard

圖7 上柱前樣品的HPLC圖譜

Figure 7 High Performance Liquid Chromatography spectra of pre column samples

圖8 二次純化后樣品的HPLC圖譜Figure 8 High Performance Liquid Chromatography map of two purified samples

2.5 硅膠柱純化后梓樹根皮總黃酮抗菌試驗

抑菌能力的強弱可以用抑菌圈直徑大小表示，抑菌能力越強直徑越大。以硅膠柱純化后梓樹根皮總黃酮進行抑菌試驗，濃度為(8.25±0.15) mg/mL。由表3可知，其對金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強，枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、青霉菌次之。根據藥敏試驗判定標準，直徑20 mm以上為極敏；15～20 mm為高敏；10～14 mm為中敏；10 mm以下為低敏；0 mm為不敏[26]。梓樹根皮總黃酮對細菌抑菌作用屬于極度敏感，對真菌屬于高度敏感。其對各供試菌種的MIC進行測定，金黃色葡萄球菌的MIC值最低，為(6.25±0.25) mg/mL；枯草芽孢桿菌、大腸桿菌MIC值為(12.50±0.36) mg/mL；釀酒酵母、青霉菌MIC值為(25.00±0.27) mg/mL。

表3 梓樹根皮總黃酮抑菌圈直徑以及MICTable 3 Antibacterial activity of total flavonoids fromCatalpa tree roots in vitro

3 結論

本試驗以吸附率和解吸率為評價指標，用大孔樹脂對梓樹根皮總黃酮的分離純化工藝進行優化，并對純化后梓樹根皮總黃酮的抑菌活性進行研究。結果表明，梓樹根皮總黃酮分離純化最佳工藝條件為NKA-II樹脂，上樣液質量濃度0.538 mg/mL，上樣液流速1.66 mL/min，上樣液pH值4.01，洗脫劑乙醇的濃度70%，洗脫流速2.5 mL/min。此條件下，梓樹根皮總黃酮純度為(77.43±0.23)%，吸附率為(93.36±0.25)%，解析率為(95.51±0.17)%。梓樹根皮總黃酮對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌作用為極敏，對青霉菌、釀酒酵母菌抑菌作用為高敏；金黃色葡萄球菌的MIC值為(6.25±0.25) mg/mL；枯草芽孢桿菌、大腸桿菌MIC值為(12.50±0.36) mg/mL；釀酒酵母、青霉菌，MIC值為(25.00±0.27) mg/mL。

本研究結果表明，梓樹根皮總黃酮對細菌、真菌都有較好的抑菌作用，后續可對其結構、活性作用方式、構效關系、作用機制等進行研究，以更好地為天然抗菌藥物的研發提供理論依據。

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Separation,purification and antibacterial activity of total flavonoids fromCatalparoot bark

SHAO Jin-huaHEFu-linCHENXiaXIEYu

(HunanUniversityofScienceandTechnology,EngineeringTechnologyResearchCenteronGinkgoofHunan,KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationofAdvantagePlantsResourcesinHunanSouth,Yongzhou,Hunan425100,China)

Taking the adsorption rate and desorption rate as the evaluation indexes, macroporous resin was adopted to optimize the separation and purification technology of total flavonoids fromCatalparoot bark, and the antibacterial activity of the purified total flavonoids fromCatalparoot bark was investigated. The results indicated that the optimal technological conditions for the separation and purification of total flavonoids fromCatalparoot bark were as follows: application of NKA-II resin; mass concentration, flow rate and pH value of loading buffer of 0.538 mg/mL, 1.66 mL/min and 4.01, respectively; concentration of eluant ethyl alcohol of 70%; and elution flow rate of 2.5 mL/min. Under such conditions, the purity, adsorption rate and desorption rate of total flavonoids fromCatalparoot bark were (77.43±0.23)%, (93.36±0.25)% and (95.51±0.17)%, respectively. Antibacterial activity indicated that total flavonoids fromCatalparoot bark had extremely sensitive antibacterial activity toEscherichiacoli,Bacillussubtilis, andStaphylococcusaureus; and high antibacterial sensitivity to penicillium andSaccharomycescerevisiae. MIC values ofS.aureus,BacillussubtilisandE.coli, as well asS.cerevisiaeand penicillium were (6.25±0.25) mg/mL, (12.50±0.36) mg/mL and (25.00±0.27) mg/mL, respectively.

Catalparoot bark; flavonoid; macroporous resin; separation and purification; antibacterial activity

湖南省教育廳重點課題(編號：16A083)

邵金華，女，湖南科技學院高級實驗師，哈爾濱商業大學在讀博士研究生。

何福林(1967—)，男，湖南科技學院教授，碩士。 E-mail:-2339695475@qq.com

2016—12—26

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.030