兩種檢測還原糖方法的比較

張學英 黃忠意 章發盛 石 艷 黃 靜

(1. 湘西自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000；2. 湖南省食品監督檢測研究院，湖南 長沙 410000)

兩種檢測還原糖方法的比較

張學英1黃忠意2章發盛1石 艷1黃 靜1

(1. 湘西自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000；2. 湖南省食品監督檢測研究院，湖南 長沙 410000)

采用費林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法測定湘西野生菊芋中還原糖(及總糖)含量，分析比較二者的測定結果及可操作性等。結果表明，費林試劑滴定法平行樣檢測RSD值為2.00%，精密度為8%～13%；3,5-二硝基水楊酸比色法平行樣檢測RSD值為1.68%，精密度為2.5%～4.0%；費林試劑滴定法易受終點計量等因素的干擾，特別是對于糖含量低的樣品檢測誤差較大，但較適用于自帶顏色產品的檢測；3,5-二硝基水楊酸比色法操作簡單、快速、適宜批量處理，其顯色反應體系在135 min內同一標準點RSD值為0.55%，且顯色反應體系相當穩定，客觀因素對其低濃度樣品影響較小，檢測結果準確度較高。

3,5-二硝基水楊酸比色法；費林試劑滴定法；菊芋；還原糖

菊芋，又名洋姜，為菊科向日葵屬多年生宿根性草本植物，地下塊莖富含菊糖，因菊糖對人體內糖含量有雙重調節作用，故菊糖是食品、保健食品和醫藥領域重要的加工原料。其地上莖稈既可作為造紙的原料，也可作為生物發電的燃料，同時由于其生長適應性強，近年在風沙治理領域運用廣泛[1-2]。菊芋在食品加工領域主要用于制作醬腌菜、蜜餞等食品，在食品精細加工及保健食品研究方面主要是對塊莖中菊糖、低聚果糖、高果糖漿等提純及應用，新鮮菊芋的總糖含量高達20%～35%，其中鮮菊芋中菊糖含量也較高達15%～20%[2-3]。

食品中還原糖(及總糖)的含量測定，有旋光法、氣相色譜法、液相色譜法、分光光度計法和化學滴定法，一般現常見有高錳酸鉀滴定法(但操作復雜、費時，需高錳酸鉀法糖類檢索表)、費林試劑滴定法(含直接滴定法和返滴定法)、濃硫酸苯酚法(此法因使用有強腐蝕性的濃硫酸，且檢測過程中比色樣液量太少而不宜使用)和3,5-二硝基水楊酸比色法等方法。實驗室常用的方法有費林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法。前人曾對滴定法、比色法兩種測糖法進行過研究，如王歡等[4]固態發酵食醋中還原糖、總糖含量測定，董林青等[5]應用不同方法測定發酵液中糖的含量，何紅梅等[6]在食品中還原糖含量測量的不確定度評估，邱曉紅等[7]在富含脂肪食品總糖含量的測定，研究了檢測方法、不確定度、前處理方法等。但對兩種檢測方法的對比研究較少，特別是檢測方法適用性研究較少，本試驗擬通過對菊芋鮮品樣品進行總糖和還原糖含量檢測方法研究，比較分析費林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法在實際應用中的利弊，并分析糖含量高低對于檢測結果的影響及方法的適用性，旨在為食品質量安全檢驗和食品企業指導生產服務。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用湘西野生菊芋和網購菊芋(浙江金華縣)作為檢測對象。

1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；

葡萄糖：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

五水硫酸銅：分析純，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；

酒石酸鉀鈉：分析純，湖南匯虹試劑有限公司；

3,5-二硝基水楊酸試劑：化學純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 設備與儀器

紫外可見分光光度計：UV-2500型，島津儀器(蘇州)有限公司；

分析天平：BSA 224S型，長沙康源科技開發有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S型，北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.4 樣品檢測

1.4.1 樣品前處理

(1) 制樣：樣品洗凈、陰干、取可食部分，用均質器均質3 min，制成均勻樣品備用。

(2) 樣品中還原糖檢測：稱取均勻樣品5～6 g置于250 mL 三角瓶中，直接用50 mL水振蕩提取(必要時加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各5 mL，用于去除蛋白質和脂肪)，然后用水定容至250 mL過濾即可。

(3) 樣品中總糖的檢測：稱取約樣品2 g置于250 mL三角瓶中，加入鹽酸水溶液(3∶20)130 mL，于三角瓶上加1 m長玻璃回流管，沸水浴中酸水解15 min，然后冷水冷卻，用6 mol/L 氫氧化鈉溶液調pH至中性(必要時加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各5 mL，用于去除蛋白質和脂肪)，并用水定容至250 mL用濾紙過濾，得總糖水解液。

1.4.2 費林試劑滴定法(簡稱滴定法)

(1) 費林AB液標定：準確吸取費林A、B溶液各5 mL放入預先加入20 mL水的200 mL錐形瓶中(可預先加入一定量的標準葡萄糖液，一般加入9～10 mL)，搖勻后置于電爐上加熱至沸騰(為使三角瓶受熱均勻及易于觀察終點顏色，可在電爐上加一石棉網)，用1.0 mg/mL葡萄糖標液滴定至終點(藍色剛好消失)，記錄消耗葡萄糖標準溶液的體積，即得K值(即費林AB液各5 mL相當于1.0 mg/mL葡萄糖標準液量)。

(2) 樣品預滴定：準確吸取費林A、B溶液各5 mL放入預先加入20 mL水的200 mL錐形瓶中，搖勻后置于電爐上加熱至沸騰，用樣品水解液滴定至終點，記錄消耗水解液的體積。

(3) 樣品正式滴定：準確吸取費林A、B溶液各5 mL放入預先加入20 mL水的200 mL錐形瓶中，加入比預滴定少1 mL的樣品水解液，搖勻后置于電爐上加熱至沸騰，用樣品水解液滴定至終點，記錄消耗水解液的體積(注：整個滴定過程控制在2 min內完成)。

(4) 還原糖(以葡萄糖計)含量計算：

(1)

式中：

X——試樣中還原糖的含量，%；

K——費林AB液各5.0 mL相當于1.0 mg/mL葡萄糖標準液量，mL；

250——樣品檢測過程定容體積，mL；

V——試樣滴定費林AB時消耗的體積，mL；

M——樣品重量，g。

1.4.3 3,5-二硝基水楊酸比色法(簡稱比色法)

(1) 樣品及標準液前處理：按表 1試驗設計取不同體積的1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液和樣品處理液放入25 mL比色管中，并補足水量至3 mL，各比色管中加入顯色試劑2.0 mL，沸水浴中加熱5 min，冰水浴中冷卻后定容至25 mL搖勻(注：沸水浴及冰水冷卻條件盡量一致)，比色反應30 min 后在540 nm波長處測定其吸光度Abs值，由葡萄糖標準液濃度(質量含量)與吸光度Abs值作標準曲線。

(2) 還原糖(以葡萄糖計)含量計算：

(2)

式中：

X——試樣中還原糖的含量，%；

m'——根據標準曲線計算得的比色液中葡萄糖含量，mg；

表1 樣品及標準液前處理設計表?Table 1 Liquid samples and standards before processing design table

? 沸水浴完成后，于冰水中快速冷卻至室溫。

250——樣品檢測過程定容體積，mL；

f——稀釋倍數；

v——比色測定時移取試樣待測液的體積，mL；

m——樣品重量，g。

2 檢測結果與數據分析

2.1 吸收光譜波長的選擇

經查王歡等[4]、董林青等[5]等論文資料，及NY/T 2332—2013《紅參中總糖含量的測定 分光光度法》等標準，對DNS比色法檢測波長通常為490，500，510，520，540 nm，本試驗通過對標準系列中間點1 500 μg 在400～600 nm進行光譜掃描，發現在540 nm處吸收最為明顯且穩定，故本試驗檢測波長用540 nm。

2.2 顯色反應體系的穩定性

通過對標準系列中間點1 500 μg在不同時間段內吸光值及標準物含量的檢測，檢測結果及數據分析見表2。

表2 顯色反應體系的穩定性?Table 2 The stability of chromogenic reaction system

? 數據分析：平均值1 559.93 μg，極差值21.57 μg，SD值8.60，RSD值0.55%。

由表2可知，標準葡萄糖1 500 μg顯色反應體系的穩定性很高，30～135 min顯色反應體系非常穩定，平均值1 559.93 μg，極差值21.57 μg，精密度均大于95%以上，RSD值0.55%。

2.3 標準曲線的情況

按表1設計所得葡萄糖標準曲線為X1=6 392.070 57Y+12.233 5，相關系數R2=0.999，估計的標準誤差為45.539 7；殘余標準偏差為40.732 0(儀器系統提供的數據)；本試驗同時用果糖作為標準品進行比色法測定，其標準曲線為X2=5 272.656 2Y-9.275 7，相關系數R2=0.999，說明兩種標準品得出的標準曲線均非常理想,標準液檢測結果及數據分析見表3。

表3 標準液檢測結果及數據分析Table 3 Standard test results and data analysis

2.4 樣品總糖檢測

用兩種不同檢測方法對同一樣品總糖進行5次平行檢測，所得檢測結果及相對平均偏差、相對標準偏差等數據分析見表4。

由表4可知，樣品總糖檢測直接滴定法重復測定5次，通過計算測定結果，相對平均偏差為1.59%，RSD為2.00%，說明其精密度比較高。用比色法對同一樣品重復測定5次，由表4中“對應比色液糖含量”和樣品檢測結果分析可知，相對平均偏差為1.37%，RSD為1.68%(因為數據分析要考慮樣品稱樣量及處理過程稀釋倍數等因素，故在此只分析檢測結果數據而不分析比色液糖含量數據)，說明樣品比色液糖含量1 500 μg以上的樣品，比色法的精密度也很高。

2.5 樣品還原糖檢測

用兩種不同檢測方法對5個樣品進行還原糖項目的檢測，所得結果及數據分析見表5。

由表5可知，比色液糖含量低于1 500 μg的樣品滴定法檢測樣品平行性較差(因為數據分析要考慮樣品稱樣量及處理過程稀釋倍數等因素，故在此只分析檢測結果數據而不分析比色液糖含量數據)，精密度一般在8%～13%，而比色法精密度一般在2.0%～4.5%，說明比色液糖含量低于1 500 μg 樣品的檢測比色法比滴定法平行性和重現性均高很多。

表4 樣品總糖檢測結果及數據分析Table 4 Samples of total sugar test results and data analysis

表5 樣品還原糖檢測結果及數據分析?Table 5 Sample reducing sugar test results and data analysis %

? 樣品1、3、5為湘西野生菊芋；樣品2、4為浙江金華菊芋；精密度是指在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的5%?！?”后數據為對應比色液糖含量，單位為μg。

2.6 不同濃度葡萄糖標液的檢測

用兩種檢測方法檢測不同溶度標準葡萄糖液，所測結果及數據分析見表6。

由表6可知，采用直接滴定法測定不同濃度(或質量含量)的葡萄糖標液含量，1 500 μg標準葡萄糖液RSD值滴定法為1.86%，比色法為3.04%，而150 μg葡萄糖標準液RSD值滴定法為5.04%，比色法3.27%，可見滴定法較適宜于檢測高濃度樣品，與2.4和2.5的分析一致。綜上可知，① 兩種方法檢測樣品的重復性均較好，但滴定法在檢測較低濃度樣品時其精密度和相對標準偏差較大，如表5中樣品1、3、4，以及表6中的150 μg的標準液，因為費林試劑滴定法影響因素較多如玻璃儀器、滴定時間、化學反應、人員因素等，且滴定法終點計量控制為1滴或半滴，而沒有更準確的計量方法，從而導致的誤差對于低濃度樣品則更為突顯。而比色法對高低濃度的檢測精密度控制均在于其氨基化合物的生成量，以化學量比關系反應作為計量方法，故濃度高低對于檢測結果影響不大(只要保證顯色劑過量和Abs值在標準曲線范圍內即可)；② 在比色法檢測過程中發現，相同濃度的標準點其每次的吸光度Abs值相差較大，故要求每次檢測樣品必同時做相同條件的標準曲線，比色法對于受熱程度、煮沸時間、冷卻時間等控制要求一致，并且每批次檢測必做相同條件的標準曲線；③ 滴定法檢測適用于高濃度樣品的檢測，其對于自帶顏色產品檢測又有其特定優勢，比色法檢測適用于高濃度和低濃度樣品檢測，但對于自帶顏色樣品的檢測受干擾影響較大。

表6 不同濃度葡萄糖標液測定結果及數據分析?Table 6 Different concentrations of glucose standard solution determination results and data analysis

? 精密度指檢測平均值減去標準值的差值與標準值比值，反應檢測值與標準值的相符性或接近性。

3 結論

試驗證明1 500 μg標準葡萄糖顯色反應體系在常溫下穩定性很高，平均值1 559.93 μg，極差值21.57 μg，精密度均大于95%以上，RSD值0.55%，標準曲線相關系數R2=0.999。在測定菊芋中總糖和還原糖含量時，費林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法均適用于較高濃度(比色液糖含量1 500 μg以上)樣品的檢測，滴定法RSD為2.00%，比色法RSD為1.68%；但對于濃度較低(比色液糖含量低于1 500 μg 以下)樣品的檢測宜使用比色法，滴定法檢測樣品平行性較差，精密度一般在8%～13%，而比色法精密度一般在2.0%～4.5%。3,5-二硝基水楊酸比色法應用較為廣泛，處理過程簡單可控，可用于大批量檢測，適用于不同含量樣品的檢測，但不適用于自帶顏色樣品的檢測。

[1] 郭洪濤, 郭衍銀. 菊芋資源開發與利用研究進展[J]. 山東農業科學, 2011(11): 69-70.

[2] 烏日娜, 朱鐵霞, 于永奇, 等. 菊芋的研究現狀及開發潛力[J]. 草業科學, 2013(8): 1 295-1 300.

[3] 趙琳靜, 燕方龍, 宋小平, 等. 菊芋菊糖的研究進展[J]. 食品研究與開發, 2008(4): 186-187.

[4] 王歡, 盧紅梅, 張義明, 等. 固態發酵食醋中還原糖、總糖含量測定[J]. 中國釀造, 2011(9): 172-174.

[5] 董林青, 牛國文, 劉志毅, 等. 應用不同方法測定發酵液中的糖含量[J]. 廣東化工, 2009(9): 177-178.

[6] 何紅梅, 陳利國, 黃輝, 等. 食品中還原糖含量測量的不確定度評估[J]. 食品與機械, 2007, 23(3): 96-97, 107.

[7] 邱曉紅, 周炳全. 富含脂肪食品總糖含量的測定[J]. 食品與機械, 2005, 21(6): 55-57.

Comparative study on two methods for sugar detection in Jerusalem artichoke

ZHANG Xue-ying1HUANGZhong-yi2ZHANHFa-sheng1SHIYan1HUANGJing1

(1.XiangxiAutonomousPrefecture,TheFoodandDrugInspection,Jishou,Hunan416000,China; 2.HunanFoodSupervisionandInspectionInstitute,Changsha,Hunan410000,China)

This paper compared the pros and cons, the operability of two methodology, by using the Fenlin reagent titration and the 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry, to determine the reducing sugar content and the total sugar content in the wildJerusalemartichokefrom Xiangxi. The RSD value is 2.00% by using Fenlin reagent titration and the precision is 8%～13%, while, the RSD value is 1.68% by using 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry and the precision is 2.5%～4.0%. It is concluded that the Fenlin reagent titration method is susceptible to the finish measurement etc factors, especially for samples with low sugar content, but is more suitable for detection of sample with color, while the 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetric method is simple, fast and suitable for batch processing, the RSD value is 0.55% when the color reaction system is in 135 min, the color reaction system is quite stable, little effect on the low concentration sample, and the result is more accurate.

3, 5-2 nitro salicylic acid colorimetry; the fehling reagent titration; inulin; reducing sugar

張學英(1975-)，女，湘西自治州食品藥品檢驗所高級工程師，碩士。E-mail: 1760013691@qq.com

2017-01-03

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.014