高靈敏黃曲霉毒素B1免疫層析定量檢測法的建立

劉 靜 王樹穎 劉道峰 賴衛華

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029)

高靈敏黃曲霉毒素B1免疫層析定量檢測法的建立

劉 靜1王樹穎1劉道峰2賴衛華1

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029)

以膠體金為標記物，借助于膠體金讀取儀，建立了高靈敏的定量檢測黃曲霉毒素B1的膠體金免疫層析方法。試紙條制備時，當標記溶液pH為6.0，檢測線全抗原的使用濃度為1.5 mg/mL，金標抗體濃度為4 μg/mL、用量為1.2 μL時，所建立方法的靈敏度為5.7 ng/L。通過加速保存試驗，結果顯示該試紙條的保存期大于1年。該試紙條應用于實際谷物及醬油加標樣本檢測，證明該方法可滿足食品快速檢測的需要。

AFB1；免疫層析；膠體金；加標回收

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌產生的次級代謝產物[1-2]。AFB1易存在于小麥、大米、花生等農作物和醬油等食品中，具有致癌性、致突變性和致畸性[3-5]。黃曲霉毒素無色、無嗅、無味，有良好的熱穩定性，通常的烹飪方式以及高壓滅菌都不能降解黃曲霉毒素[6]。由于AFB1對食品及飼料的污染范圍較廣，會危害人畜健康，所以許多國家和組織制定了食品和飼料中AFB1的最高限量標準。歐盟規定直接提供給人類食用的食物及其成分中AFB1的含量不能超過2 μg/kg，AFB1、B2、G1、G2的總量不得超過4 μg/kg；日本規定食品中AFB1的含量不能超過10 μg/kg。中國食品中AFB1允許量標準 (GB 2761—2011) 規定：玉米、花生及其制品中不得超過20 μg/kg，大米、植物油(除玉米、花生油)中不得超過10 μg/kg，其他糧食、豆類、發酵食品及嬰幼兒配方食品中不得超過 5 μg/kg[7]。

AFB1主要的測定方法有高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-質譜聯用法[10-11]、酶聯免疫吸附法[12-13]、免疫層析方法[14-16]等。高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯用法等儀器法靈敏度高、重復性好、可實現準確的定量檢測，但樣品前處理相對復雜，檢測周期長，需要專業人員操作。酶聯免疫吸附法具有靈敏度高、檢測時間較短等優點，但需要專業人員操作，不能現場檢測，因此限制了該方法的普及推廣。以膜為固相載體的免疫層析法由于其快速、便捷的優點，越來越受到人們的重視。近年來發展迅速的膠體金試紙條檢測技術，其靈敏度高、對操作人員要求低，并且不需要昂貴的儀器設備，被認為是目前最具應用價值和發展潛力的分析技術之一。大多數已報道的AFB1試紙條檢測以定性檢測為主[15-16]，定量檢測方法研究較少。王督等[17]采用自主研制的AFB1膠體金免疫定量檢測卡，建立花生、玉米、大米、小麥等糧油農產品中AFB1的定量分析方法，4種樣品檢測的線性范圍為1.0～20.0 μg/kg，方法的定量限為 1.0 μg/kg。徐振斌等[18]立了定量檢測玉米中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量的膠體金免疫層析法，方法的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為3.0 μg/kg。本試驗建立了AFB1的膠體金免疫層析定量檢測法，且靈敏度較高，可以通過稀釋來降低基質干擾，滿足檢測要求，有效地擴大了檢測范圍。

本試驗擬采用免疫層析的方法，以膠體金為標記材料，通過金納米顆粒在檢測線的富集顯示出顏色信號，結合膠體金信號讀取儀量化信號強度，最后經計算檢測線和控制線信號強度的比值(T/C值)來分析待測物的具體濃度。在優化系列參數的基礎上，建立AFB1的膠體金免疫層析定量檢測方法，并用于實際樣本中AFB1的檢測，結合較為簡單的前處理方法，可有效提高篩查的效率，同時其靈敏度也符合中國對AFB1的檢測標準，可用于大批量現場篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

AFB1標準品：純度≥99%，美國Sigma公司；

牛血清白蛋白(BSA)：純度96%，美國Amresco公司；

PEG 20000: 純度≥99%，德國Merck公司；

抗AFB1單克隆抗體、AFB1-BSA檢測抗原、膠體金復溶液、30 nm膠體金：無錫中德伯爾生物技術有限公司；

驢抗鼠IgG：北京中衫金橋生物技術有限公司；

PVC黏性底板、聚酯膜、吸水紙、玻璃纖維膜：上海金標生物技術有限公司。

1.1.2 儀器

三維噴點平臺：XYZ3050型，美國Bio-Dot公司；

真空干燥機：DZX-6090B型，上海福瑪實驗設備有限公司；

膠體金試紙條讀取儀：HG-8型，上海互幗科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金標記抗體 取2 mL膠體金溶液于潤洗好的燒杯中，用0.2 mol/L的K2CO3調節pH，在室溫下用磁力攪拌器攪拌均勻；在磁力攪拌下逐滴緩慢加入AFB1單抗，室溫下攪拌反應1 h，抗體的加入體積是膠體金總體積的1/10；之后逐滴加入1%的PEG 20000進行封閉，室溫下攪拌反應30 min，PEG 20000的加入體積是膠體金總體積的1/10；再逐滴加入10%的BSA進行第二步封閉，加完后攪拌反應30 min，BSA的加入量是膠體金總體積的1/10；經過8 000 r/min、4 ℃離心30 min后棄上清，沉淀用200 μL膠體金復溶液進行復溶。

1.2.2 膠體金免疫層析試紙條的組裝及檢測 用XYZ3050型三維噴點平臺在結合墊上噴上一定量的金標抗體，將一定濃度的AFB1—BSA和驢抗鼠二抗噴在NC膜上作為檢測線(T線)和質控線(C線)。膠體金免疫層析試紙條的組裝過程，首先將吸水紙、上述制備的NC膜、結合墊、樣本墊和聚酯纖維膜依次粘貼在PVC底板上，然后用切條機切割成3.9 mm 寬的細條并組裝在塑料卡殼中。檢測時，將制備好的膠體金試紙條取出，將100 μL待檢樣品加入到加樣孔中，反應一定時間后用膠體金讀取儀讀取T、C線數值以及T/C比值。

(1) 膠體金標記抗體pH值：固定膠體金標記抗體量4 μg/mL，金標抗體用量1.2 μL，檢測抗原濃度1.5 mg/mL，膠體金標記抗體pH值分別選取5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，將100 μL陰性樣品加入到加樣孔中，反應20 min后用膠體金讀取儀讀取T、C線數值以及T/C值，每組做3個平行。

(2) 膠體金標記抗體量：固定膠體金標記抗體pH值為 6.0，金標抗體用量1.2 μL，檢測抗原濃度1.5 mg/mL，膠體金標記抗體量分別選取2，4，6，8，10 μg/mL，反應20 min后用膠體金讀取儀讀取T、C線數值以及T/C值，每組做3個平行。

(3) 金標抗體用量：固定膠體金標記抗體pH值為 6.0，膠體金標記抗體量4 μg/mL，檢測抗原濃度1.5 mg/mL，金標抗體添加體積分別選取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 μL。反應20 min后用膠體金讀取儀讀取T、C線數值以及T/C值，每組做3個平行。

(4) 檢測抗原濃度：固定膠體金標記抗體pH值為 6.0，金標抗體用量1.2 μL，膠體金標記抗體量4 μg/mL，檢測抗原濃度分別選取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，反應20 min后用膠體金讀取儀讀取T、C線數值以及T/C值，每組做3個平行。

(5) 免疫動力學曲線的研究：制備膠體金免疫層析試紙條，加樣后，每個試紙條每隔1.5 min讀取一次T線值和C線值，根據T線值和C線值的比值數據(T/C值)，得到免疫動力學曲線。

1.2.4 AFB1定量標準曲線的建立 經LC—MS/MS確證為AFB1陰性的樣品中添加AFB1標準品，制備AFB1系列標準溶液 (0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L)。取AFB1標準溶液用膠體金試紙條檢測，記錄試紙條T/C 值，每個濃度重復檢測3次。以AFB1濃度對數為橫坐標，T/C值為縱坐標，建立標準曲線。

1.2.5 膠體金免疫層析方法的性能評價

對照組給予常規用藥治療,常規抗感染、吸氧和止咳等,糾正酸堿紊亂和水電解質紊亂,靜脈滴注3.75g尼可剎米+500ml濃度5% 的葡萄糖溶液。

(1) 膠體金免疫層析方法靈敏度：配制不同濃度的AFB1標準溶液(0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L)。分別用膠體金免疫層析試紙條進行檢測，每個濃度重復檢測3次。加樣20 min后用膠體金讀取儀讀取數值。平行試驗結果取平均值后，繪制標準曲線，參考Anfossi等[19]的方法計算該層析方法的靈敏度。

(2) 膠體金免疫層析方法可重復性：配制不同濃度的AFB1標準溶液(0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L)。每個濃度做10個平行檢測。

(3) 膠體金免疫層析方法穩定性：在37 ℃和60 ℃下進行加速保存試驗。37 ℃時，測試的時間為：第0、7、14、28、56、105天，以及第6個月和第12個月。60 ℃時，測試的時間為：第0、1、2、3、5、7天。

1.2.6 樣本前處理及加標回收試驗 用不含AFB1的大米，小米樣品作為空白樣品進行加標回收試驗，每個加標濃度同時做3組平行。首先將谷物樣本研磨，過20目篩。加入AFB1標準品，使AFB1含量為5 μg/kg。然后準確稱取2 g谷物樣本于100 mL三角瓶中，加入30 mL 60%甲醇—水溶液對谷物中的AFB1進行萃取，充分振蕩20 min。取1 mL收集好的濾液于離心管中，最后加入2 mL蒸餾水稀釋。此稀釋液即為待檢樣。用制備好的膠體金免疫層析試紙條進行檢測，根據加標濃度計算出加標回收率。

從本地超市購得魯花醬油、廚邦醬油兩個品牌的醬油，經LC—MS/MS確證為AFB1陰性樣品。加入AFB1標準品，使醬油樣本中的AFB1含量最終為5 μg/L。用水稀釋100倍，用制備好的膠體金免疫層析試紙條進行檢測，根據加標濃度計算出加標回收效率。

結合繪制好的標準曲線和線性回歸方程得出提取液中待檢物質的濃度。

加標回收率根據式(1)計算：

(1)

式中：

R——加標回收率，%；

v1——檢出濃度，μg/kg；

v2——加標濃度，μg/kg；

n——稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 膠體金免疫層析試紙條的制備及檢測

由圖1可知，當待測樣本為陰性(0 μg/L)時，T線出現很強的紅色條帶，隨著待測物濃度的升高，T線條帶的強度越來越弱，C線條帶的強度越來越強，相應的T/C值呈現一定的梯度變化，符合定量檢測的要求。

從左至右，樣本加標濃度依次為0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L

圖1 膠體金免疫層析試紙條檢測結果

Figure 1 Detection result of the colloidal gold immunochromatographic test strips

2.2 膠體金免疫層析法條件優化

2.2.1 膠體金標記抗體pH值的優化 由圖2(a)可知，T線的信號強度隨著pH的降低而增強，在pH 6.0時，T線的信號值最強，即抗體的標記效率最高，因此選取pH 6.0為最佳。這是由于隨著pH的降低，蛋白表面聚集的正電荷增多，在靜電吸附下能夠更有效地與表面帶負電的膠體金顆粒結合。但是當膠體金在pH 5.0的條件下標記抗體時出現了死金的現象。

2.2.2 膠體金標記抗體量的優化 由圖2(b)可知，隨著抗體標記量的增加，T/C值呈上升趨勢。隨著T/C值的增大，平行試驗之間的變異系數也逐漸增大，意味著檢測結果的可重復性降低。這可能是在抗體用量達到一定水平時，T線上呈現的信號強度達到讀取儀的臨界值，從而得到不準確且偏差較大的讀數。因此，綜合考慮節省抗體、檢測結果的CV值和靈敏度，最終選取4 μg/mL為最佳抗體標記量。

圖2 膠體金免疫層析法條件的優化Figure 2 Optimization of the colloidal gold immunochromatographic test strips

2.2.3 金標抗體用量的優化 由圖2(c)可知，T/C值隨著金標抗體用量的增加呈現先變大后減小的趨勢，在金標抗體用量為1.2 μL時，T/C值較大且抗體用量較少。這可能是在金標抗體用量達到一定程度后，T線上的全抗原被結合完全，剩余的金標抗體隨層析反應移動到C線上，與二抗結合，使得C線顯示的信號值隨金標抗體用量的增加而逐漸升高，從而導致T/C逐漸降低，因此選用1.2 μL為最佳的金標抗體用量。

2.2.4 檢測抗原濃度的優化 由圖2(d)可知，隨著全抗原濃度的增加，試紙條的T/C值有所升高，在1.5 mg/mL之后，T/C值趨于平穩。這是由于T線上全抗原濃度越高，結合的金標抗體越多，T線上呈現的信號強度就越強，同時移動到C線上的金標抗體量就越少，C線的信號強度也越弱，兩者共同導致T/C值變大。在T線抗原濃度為1.5 mg/mL時，T/C值較大，且平行試驗間的變異系數(CV值)較小(5個濃度檢測結果CV值分別為：9%，10%，5%，8%，11%)，所以選擇1.5 mg/mL為最佳的T線抗原濃度。

2.2.5 免疫動力學曲線 在免疫層析分析中，反應時間的確定非常重要，若時間過短，抗原抗體之間的反應不完全。由圖3可知，在前7 min，T/C值逐漸變大，在7～15 min時一直處于下降趨勢，在15 min后T/C值趨于穩定，說明15 min后抗原抗體反應達到平衡，因此選取15 min為本試紙條的檢測時間。

2.3 膠體金免疫層析方法的性能評價

2.3.1 膠體金免疫層析方法靈敏度的評價 參考Anfossi等[19]的方法，根據陰性的平均值減去3倍的標準偏差，計算出本檢測方法的靈敏度為5.7 ng/L。檢測方法的標準曲線見圖4。線性方程為Y=-0.563 9ln (x)-0.335 3，線性范圍0.02～0.20 μg/kg。

2.3.2 膠體金免疫層析方法可重復性的評價 用20%甲醇—水溶液配制了不同濃度的標準溶液，每個濃度設置10個平行對照，用制備好的試紙條檢測，計算平行數據之間的CV值，評價該試紙條的可重復性，試驗結果見表1。由表1可知，平行數據間的CV值均<13%，重復性較好。

2.3.3 膠體金免疫層析方法穩定性的評價 在37 ℃下保存100 d后，檢測結果并沒有出現明顯的差別(圖5)，可見該試紙條的保存期在37 ℃下不小于100 d。由圖6可知，在60 ℃條件下進行高溫試驗，保存7 d，陰性樣本的T/C值沒有降低，說明該膠體金免疫層析產品在高溫下具有很好的穩定性。

圖3 免疫動力學曲線結果Figure 3 Optimization of immunoreaction time

圖4 檢測方法的標準曲線Figure 4 Standard curve of the detection method

表1 試驗方法的CV值Table 1 CV of the detection method

圖5 37 ℃條件下不同保存天數T/C值的變化Figure 5 Changes of T/C values after different save days under 37 ℃

圖6 60 ℃條件下不同保存天數T/C值的變化Figure 6 Changes of T/C values after different save days under 60 ℃

2.4 樣本的加標回收試驗

應用已制備好的膠體金免疫層析試紙條進行檢測，分別計算出了各個樣品的加標回收效率。大米、小米的加標濃度為5 μg/kg，回收率分別為73.35%和63.28%，CV值為5.95%和7.74%，CV值均小于10%。廚邦醬油和魯花醬油的加標濃度為5 μg/L，回收率分別為107.80%和93.06%，CV值為8.51%和8.24%，CV值均小于10%，說明本試驗制備的膠體金免疫層析試紙條可用于實際樣本的檢測。

3 結論

小分子檢測時試紙條定性分析單純追求T線消線，而試紙條的定量檢測則需要保證線性范圍內T、C線顏色均不消失，且控制T/C值隨著濃度的變化成梯度變化。本試驗主要對用于定量檢測的膠體金免疫層析試紙條的各項條件進行了優化。在最優條件下，建立了AFB1的膠體金免疫層析定量檢測法，確定了該方法的靈敏度、可重復性，平衡時間等指標，并對試紙條的穩定性及保存時間做了初步評價。結果顯示，在pH 6.0的條件下抗體的標記效率最高，抗體標記量為4 μg/mL，T線抗原的濃度為1.5 mg/mL，金標抗體的用量為1.2 μL時，制備的試紙條靈敏度較好(5.7 ng/L)。由于靈敏度較高，該方法可以通過高稀釋倍數來降低基質干擾，有效地擴大了檢測范圍。免疫層析技術存在的一個比較突出的問題是它的不穩定性，對膠體金免疫層析試紙條的穩定性可進一步研究，提高其穩定性，以用于產業化大生產，得到商業化的產品。

[1] GOLGE O, HEPSAG F, KABAK B. Determination of aflatoxins in walnut sujuk and Turkish delight by HPLC-FLD method[J]. Food Control, 2016, 59: 731-736.

[2] WU Ling-xia, DING Xia-xia, LI Pei-wu, et al. Aflatoxin contamination of peanuts at harvest in China from 2010 to 2013 and its relationship with climatic conditions[J]. Food Control, 2016, 60: 117-123.

[3] BUMBANGI N F, MUMA J B, CHOONGO K, et al. Occurrence and factors associated with aflatoxin contamination of raw peanuts from Lusaka district's markets, Zambia[J]. Food Control, 2016, 68: 291-296.

[4] SALAS M P, POK P S, RESNIK S L, et al. Use of citrus flavanones to prevent aflatoxin contamination using response surface methodology[J]. Food Control, 2016, 60: 533-537.

[5] 賴先文, 張荷, 劉承蘭. 稻米中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素 A 的研究進展[J]. 食品工業科技, 2014, 35(22): 386-391.

[6] 曹銘, 樊明濤. 黃曲霉毒素脫除技術研究進展[J]. 食品與機械, 2015, 31(1): 260-264.

[7] 余以剛, 邱楊, 吳暉, 等. 幾種傳統食品中黃曲霉毒素B1的檢測與安全評價[J]. 食品與機械, 2007, 23(4): 110-111.

[8] 中國疾病預防控制中心營養與食品安全所. GB/T 5009.23—2006食品中黃曲霉毒素B1、 B2、 G1、 G2的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2012.

[9] KABAK B. Determination of aflatoxins and ochratoxin A in retail cereal products from Turkey by high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Food Control, 2012, 28(1): 1-6.

[10] 康紹英, 周興旺, 張繼紅, 等. 液相色譜—串聯質譜法同時檢測食品中的 4 種黃曲霉毒素[J]. 食品與機械, 2013, 29(2): 77-81, 120.

[11] FAN Su-fang, LI Qiang, SUN Lei, et al. Simultaneous determination of aflatoxin B1and M1in milk, fresh milk and milk powder by LC-MS/MS utilising online turbulent flow chromatography[J]. Food Additives & Contaminants: Part A, 2015, 32(7): 1 175-1 184.

[12] KOLOSOVA A Y, SHIM W B, YANG Z Y, et al. Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1. Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2006, 384(1): 286-294.

[13] 江湖. 黃曲霉毒素 B1間接競爭 ELISA 檢測方法的建立與單克隆抗體免疫親和柱的初步研制[D]. 南昌: 南昌大學, 2005:31-51.

[14] LIU Dao-feng, HUANG Yan-mei, CHEN Ming-hui, et al. Rapid detection method for aflatoxin B1in soybean sauce based on fluorescent microspheres probe[J]. Food Control, 2015, 50: 659-662.

[15] 鄧省亮, 賴衛華, 許楊. 膠體金免疫層析法快速檢測黃曲霉毒素B1的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(2): 232-236.

[16] 賴衛華, 劉道峰, 鄧省亮. 膠體金免疫層析法檢測醬油中黃曲霉毒素 B1[J]. 食品與機械, 2012, 28(1): 70-72.

[17] 王督, 張文, 李培武, 等. 膠體金免疫層析法快速定量分析糧油農產品中黃曲霉毒素 B1[J]. 中國油料作物學報, 2014, 36(4): 529.

[18] 徐振斌, 胡東青, 里南, 等. 膠體金免疫層析法快速定量檢測玉米中黃曲霉毒素[J]. 糧食科技與經濟, 2013, 38(3): 24-26.

[19] ANFOSSI L, BAGGIANI C, GIOVANNOLI C, et al. Optimization of a lateral flow immunoassay for the ultrasensitive detection of aflatoxin M1in milk [J]. Analytica Chimica Acta, 2013, 772: 75-80.

Development of Quantitative Sensitive Immunochromatographic Assays for Detection of Aflatoxin B1

LIU Jing1WANGShu-ying1LIUDao-feng2LAIWei-hua1

(1.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330047,China;2.JiangxiProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang,Jiangxi330029,China)

The aim of this work was to establish a highly sensitive quantitative colloidal gold immunochromatographic assay with a test strip reader for the detection of aflatoxin B1using colloidal gold as label. When the labeling pH was 6.0, the concentration of antigen on T-line was 1.5 mg/mL, the concentration of antibody labeled on the colloidal gold was 4 μg/mL, and the dosage of gold-labeled antibody was 1.2 μL, the sensitivity of the assay was 5.7 ng/L. The results of accelerated aging experiment indicated that the strips shelf time was more than a year. It was proved that this method can meet the needs of the rapid detection of food when the strip was applied to detect cereals and soybean sauce.

AFB1; immunochromatographic assay; colloidal gold; recovery rate

江西省主要學科學術和技術帶頭人培養計劃項目(編號：20113BCB22007)；江西省教育廳落地項目(編號：KJLD13009)

劉靜，女，南昌大學在讀碩士研究生。

賴衛華(1968-)，男，南昌大學教授，博士生導師。 E-mail:talktolaiwh@163.com

2016-12-09

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.011