第二代基因測序儀的硬件設計

韓九強，吳思佳＊，劉瑞玲，呂紅強，鐘德星

（西安交通大學電子與信息工程學院，西安，710049）

第二代基因測序儀的硬件設計

韓九強，吳思佳＊，劉瑞玲，呂紅強，鐘德星

（西安交通大學電子與信息工程學院，西安，710049）

隨著基因序列分析研究的深入，中短基因片段的快速準確測序已經(jīng)成為生物信息研究的瓶頸。本文針對第二代基因測序儀的硬件設計問題，在深入研究第二代基因測序原理和流程的基礎上完成了硬件總體方案設計。此方案采用自上而下逐步分解的方法，設計了流動槽、PCR、邊合成邊測序、控制與數(shù)據(jù)傳輸?shù)扔布K，繼續(xù)分解設計了溫度控制、試劑控制、激光觸發(fā)、光學采集、掃描控制等硬件子模塊，并根據(jù)各個子模塊的功能和廠商的產(chǎn)品說明書完成了部分關鍵器件的選型。為后續(xù)基因測序儀的機械結構設計和硬件組裝奠定了基礎。

生物信息學；基因測序儀；邊合成邊測序；硬件設計

引言

隨著科學技術的進步，在大批量測序任務處理中，第一代測序法易受成本高、速度慢、通量低等因素的限制，越來越無法滿足科學研究和生產(chǎn)應用的需要。于是，以Roche公司的454技術[1,2]、Illumina公司的Solexa技術[3]和ABI公司的SOLiD[4]為標志的第二代基因測序技術應運而生。與第一代基因測序技術相比，第二代基因測序技術在實現(xiàn)高通量測序的同時，不僅保持了較高的準確度，而且大大降低了測序成本并極大地提高了測序速率[5]。第二代基因組技術對于揭示基因組的結構和功能有重要的推動作用，在功能基因組、系統(tǒng)生物學、藥物基因組等的研究中有廣泛的應用[6-8]。

1 測序流程

第二代基因測序技術有多種實現(xiàn)平臺，但它們的測序流程在概念上是相似的，均包括文庫制備、乳液或橋式PCR擴增和合成或連接測序等過程。我們以Solexa測序技術為例研究第二代基因測序流程，如圖1所示。測試流程主要包括測序試劑的準備、邊合成邊測序（包含合成反應和光學圖像采集處理流程）、序列拼接組裝三個階段。具體內(nèi)容將在如下介紹。

1.1 測序試劑的準備

測序試劑的準備主要包含DNA提取、DNA碎片化、DNA片段處理和PCR擴增4個階段。DNA提取：通過研磨敲碎、超聲波、冷融、堿或酶等方法裂解細胞，加入去污劑、蛋白酶、醋酸鹽等試劑去除掉膜脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后利用吸附材料結合法、濃鹽法、有機溶劑抽提法或密度梯度離心法等獲得DNA溶液[9]。DNA碎片化：使用超聲儀器等設備將DNA隨機打斷成片段。DNA片段處理：DNA片段經(jīng)過末端修飾等操作后固定到流動槽的接頭上。PCR擴增[10]：在流動槽上，通過對溫度、試劑等參數(shù)的控制，使得流動槽上之前通過接頭固定的每一個DNA片段都完成了上萬倍的復制形成了簇，完成DNA擴增。

圖1 第二代基因測序流程Fig. 1 process of next-generation sequencing

1.2 邊合成邊測序

邊合成邊測序是第二代基因測序能夠大規(guī)模并行的關鍵。邊合成邊測序主要包括合成反應堿基延伸、熒光激發(fā)及信號收集、剪切3個步驟。合成反應堿基延伸：利用ddNTP（ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP）完成合成反應，ddNTP具有終止DNA鏈延伸的作用，待測片段在每一個反應中會生成不同長度的終止于該反應中包含的ddNTP的堿基片段。熒光激發(fā)及信號收集：四種堿基參與合成反應，由于結合不同的ddNTP在激光照射下會發(fā)出不同頻率的熒光信號，光學采集系統(tǒng)掃描記錄下這些熒光，經(jīng)過一定的去噪等處理，通過計算機軟件等將光信號轉化為測序峰值信號，獲得一定長度的堿基讀取Read。剪切：采集信號完成后，關閉激光，用剪切劑去除測序序列延伸產(chǎn)物上的堿基所標記的熒光基團，為下一輪測序做準備。這三個步驟依次循環(huán)直至達到人為指定的最高循環(huán)次數(shù)，即每個測序片段的讀長。

1.3 序列拼接組裝

獲得的堿基讀取Read的長度較短，需要通過貪婪算法[11]、基于De Bruijn圖的算法[12]等方法并結合已有的信息完成序列的拼接工作，以得到更長的Contig甚至完整的待測基因序列，或者將Read比對到已有的基因組或者相近物種基因組上。這一部分是計算機軟件部分的工作內(nèi)容，其具體過程在本文中不做詳細介紹。

圖2 基因測序儀硬件總體方案Fig.2 Hardware design of next-generation sequencing instrument

表1 硬件需求表Tab.1 hardware requirements

表2 硬件選型表Tab.2 hardware selection

2 硬件設計

依據(jù)基因測序流程，可以將基因測序儀的硬件結構按照所完成的功能劃分到不同的模塊中。基因測序儀的硬件總體結構方案如圖2所示。

2.1 流動槽模塊

流動槽也叫做基因芯片[13,14]，是基因測序流程中PCR擴增和邊合成邊測序的場所。在流動槽的橫向分布著兩條長方形的通道Lane。每條Lane上等間隔地分布著數(shù)十個布置有接頭的方形塊Tile，當待測DNA試劑流過Tile上方的時候，DNA片段被以共價鍵的形式隨機地固定在Tile的接頭上。流動槽被固定在流動槽固定臺上。

2.2 PCR模塊

PCR模塊控制DNA片段完成PCR擴增，包括溫度控制和試劑控制兩個子模塊。在溫度控制子模塊中，4個溫度傳感器均勻地分布在流動槽上，實時獲得擴增過程的溫度，并根據(jù)PCR擴增中高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個階段所需的溫度不同[15,16]，接收控制與數(shù)據(jù)傳輸模塊命令，控制電熱片和制冷片2個執(zhí)行器的工作。在試劑控制子模塊中，2個流量傳感器實時獲得擴增過程中原料供給情況，并根據(jù)PCR擴增中不同階段所需試劑和PH值不同，接收控制與數(shù)據(jù)傳輸模塊命令，控制試劑泵的開啟及向2條Lane泵入原料試劑的流量，使得PCR擴增獲得所需的原料和合適的PH環(huán)境。

2.3 邊合成邊測序模塊

邊合成邊測序模塊完成合成反應和光學圖像采集處理兩個工作。類似PCR模塊，合成反應不同階段所需溫度和試劑也不同，需要溫度控制子模塊和試劑控制子模塊控制電熱片、制冷片和試劑泵為合成反應提供合適溫度和所需的原料。光學圖像采集處理則需要激光觸發(fā)子模塊、光學采集子模塊和掃描控制子模塊的協(xié)同工作。在激光觸發(fā)子模塊中，紅激光光源對應A, C堿基，綠激光光源對應G, T堿基。在光學采集子模塊中，四組濾光片分別對應四種堿基反射的熒光，四個光學CCD相機分別采集記錄相應的熒光信號，并傳輸給控制與傳輸子模塊中轉化為峰值信號繼而獲得對應的序列堿基。在掃描控制子模塊中，兩個位移傳感器獲得流動槽固定臺在X和Y軸中的位置，接收控制與傳輸子模塊的命令，控制步進電機，移動流動槽固定臺，以獲得流動槽上所有Tile定期循環(huán)結果。

2.4 控制與傳輸模塊

控制與傳輸模塊是基因測序儀的邏輯控制中心和圖像數(shù)據(jù)處理中心。向下，控制與數(shù)據(jù)傳輸模塊接收來自上位機的控制信息，依據(jù)上位機的指令，通過儀器控制子模塊命令具體的執(zhí)行器執(zhí)行一些特定的動作；向上，控制與數(shù)據(jù)傳輸模塊接收光學采集子模塊獲得的熒光信號，通過圖像處理子模塊轉化為堿基數(shù)據(jù)，并通過數(shù)據(jù)上傳子模塊將這些堿基數(shù)據(jù)和基因測序儀器的狀態(tài)信息傳給上位機。

3 硬件選型

將基因測序儀的硬件劃分為各個子模塊后，了解各個子模塊中傳感器、執(zhí)行器需求和參數(shù)，如表1所示。通過查詢各個廠商產(chǎn)品的說明書，選擇各個傳感器和執(zhí)行器，如表2所示。控制與輸出模塊選擇一塊帶有網(wǎng)卡和多個其他接口的控制板并且安裝運行Linux 2.6內(nèi)核操作系統(tǒng)，這樣驅動程序的書寫簡化為Linux內(nèi)核模塊的編寫，控制和數(shù)據(jù)傳輸程序也簡化為在Linux平臺上開發(fā)網(wǎng)絡數(shù)據(jù)傳輸程序，同時，由于Linux系統(tǒng)對硬件的要求不高，可以降低基因測序儀的硬件成本。

4 結論與展望

本文研究了基因測序技術的原理和流程，詳細地了解了基因測序儀的各個硬件部分及其需要完成的功能，對基因測序儀的硬件結構進行了模塊化的劃分，且完成了一些關鍵硬件器件的研究和選型。隨后需要對基因測序儀的硬件部分進行下一步的機械結構設計等，并在這些結構設計完成后，采購需要的硬件來組裝成完整的基因測序儀以驗證硬件設計的正確性。

致謝

本論文的完成離不開西安交通大學各位老師和同學的幫助，特別感謝謝盼、朱異靈等對本論文提出的意見和建議。

[1] Rothberg J M, Leamon J H. The development and impact of 454 sequencing [J]. Nature Biotechnology, 2008, 26(10): 1117-1124.

[2] Margulies M, Egholm M, Altman W E,et al. Genome sequencing in open microfabricated high-density picoliter reactors [J]. Nature, 2005, 437(7057): 376--380.

[3] Bentley D R, Balasubramanian S, Swerdlow H P,et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry [J]. Nature, 2008, 456(7218): 53-59.

[4] Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T,et al. A high-resolution, nucleosome position map of C. elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning [J]. Genome Research, 2008, 18(7): 1051-1063.

[5] Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing [J]. Nature Biotechnology, 2008, 26(10): 1135-1145.

[6] Ouyang Z, Zhou Q, Wong W H. ChIP-Seq of transcription factors predicts absolute and differential gene expression in embryonic stem cells [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(51): 21521-21526.

[7] Taylor K H, Kramer R S, Davis J W,et al. Ultradeep bisulfite sequencing analysis of DNA methylation patterns in multiple gene promoters by 454 sequencing [J]. Cancer Research, 2007, 67(18): 8511-8518.

Hardware Design of Next-generation Sequencing Instrument

Han Jiuqiang, Wu Sijia*, Liu Ruiling, Lv Hongqiang, Zhong Dexing
(School of Electronic and Information Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049)

With the development of genomics, fast and accurate short DNA fragments sequencing has become the bottleneck of bioinformatics research. In this paper, theory and method of high throughput sequencing is deeply studied. Based on top-down policy, four modules and eight sub-modules have been designed, which are flow cell, PCR, sequencing-by-synthesis and control modules with temperature control, reagent control, laser control, optical collection, scanning control, device control, image processing and data transmission sub-modules. In the end, the main hardware parts have also been selected according to the functions of submodules and product specification. This work will be the basis of further mechanism design and hardware assembling of sequencing instrument.

bioinformatics; DNA sequencing instrument; Sequencing-by-Synthesis; Hardware design

TP183

A

10. 11967/ 2017150110

TP183

A DOI：10. 11967/ 2017150110

高等學校博士學科點專項科研基金（20110201110010）。

韓九強，男，教授，主要研究方向：機器視覺，生物信息學。

吳思佳，女，博士研究生，主要研究方向：生物信息學，Email: wsj_xjtu_1332@163.com.