CRISPR-Cas9基因編輯技術在構建實驗動物腫瘤模型中的應用進展

熊偉，楊勇琴，自加吉，孫美濤，梅雯，左紹遠，張曉娟

1.大理大學 基礎醫學院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000；3.大理市第一人民醫院 呼吸內科，云南 大理 671000

CRISPR-Cas9基因編輯技術在構建實驗動物腫瘤模型中的應用進展

熊偉1,2，楊勇琴1，自加吉1，孫美濤1，梅雯1，左紹遠1，張曉娟3

1.大理大學 基礎醫學院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000；3.大理市第一人民醫院 呼吸內科，云南 大理 671000

CRISPR-Cas9是一種以細菌和古細菌抵御外源核酸入侵的免疫機制為基礎開發出來的新型基因編輯技術。與傳統的鋅指核酸酶（ZFN）、胚胎干細胞（ES細胞）打靶和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（TALEN）技術相比，該基因編輯技術具有操作簡單、更加高效、更容易獲得純合子突變體、細胞毒性小、無物種限制等優勢，但也存在脫靶效應等缺點。目前，CRISPR-Cas9技術已被廣泛用于腫瘤相關研究中，尤其在構建實驗動物腫瘤模型中取得許多重要成果。我們主要對CRISPR-Cas9基因編輯技術在構建實驗動物肝癌模型、結直腸癌模型、肺癌模型、宮頸癌模型、白血病模型、腦瘤模型中的研究現狀及應用進展做簡要綜述。

CRISPR-Cas9；基因編輯；腫瘤；應用進展

CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nucle?ase 9）是古細菌和細菌在長期進化過程中形成的一種適應性免疫防御，用來保護自身基因組免受病毒、噬菌體及其他外源核酸的破壞和干擾[1]。每個CRISPR含有多個長24～48bp的重復序列，而這些重復序列被長度為26～72bp的間隔序列（spacer DNA）分隔開。CRISPR-Cas9系統將入侵噬菌體及質粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應的CRISPR RNAs（crRNAs）來指導同源序列的降解，從而提供免疫性[2]。目前，由Ⅱ型CRISPR改造而來的CRISPR-Cas9系統在研究中被廣泛使用，并已發展成為一種可用于基因組編輯的分子生物學利器[3-4]。CRISPR-Cas9技術已被廣泛用于腫瘤的相關研究，尤其在構建實驗動物腫瘤模型中取得許多重要成果。

實驗動物腫瘤模型的建立，為揭示腫瘤發生發展過程的分子機制及探索腫瘤的治療方法奠定了基礎。實驗動物模型是可以將基礎和臨床腫瘤研究有效整合和建立密切聯系的理想載體，已被廣泛用于腫瘤研究的多個領域。目前，建立實驗動物腫瘤模型的方法基本可分為4類：移植型實驗動物腫瘤模型、自發和誘發實驗動物腫瘤模型、基因敲除實驗動物腫瘤模型、轉基因實驗動物腫瘤模型[5]。其中，基因敲除動物腫瘤模型是指利用基因敲除方法去除抑制腫瘤發生相關的基因，從而誘導動物腫瘤發生的動物模型[6]。這對于認識單一基因或數個基因在腫瘤發生中的作用是一種理想的模型。隨著基因編輯技術的開發和進步，也同樣促進了用于研究人類惡性腫瘤特點的實驗動物腫瘤模型的開發。因此，科學家們迫切需要一種高效且快速的基因編輯技術，可以精確地控制細胞內基因的表達水平。相對于傳統的基因編輯技術，如鋅指核酸內切酶（zinc-finger nucleases，ZFN）[7]、胚胎干細胞（em?bryonic stem cells，ES細胞）打靶[8]和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術[9]，CRISPR-Cas9技術更好地滿足了科學家們在此方面的需求。由于CRISPR-Cas9系統沒有物種限制，已成功地在小鼠、大鼠、食蟹猴、家豬、線蟲、斑馬魚等多種實驗動物中實現了精準的基因編輯[10-17]。我們對近年來CRISPR-Cas9基因編輯技術在構建實驗動物腫瘤模型中的研究現狀及應用進展做簡要綜述。

1 CRISPR-Cas9基因編輯技術的工作原理

CRISPR-Cas9基因編輯系統由有核酸內切酶活性的Cas9蛋白和單鏈的singleguideRNA（sgRNA）組成。CRISPR-derived RNA（crRNA）通過堿基配對與trans-activating RNA（tracrRNA）結合形成crRNA/tracrRNA復合物，此復合物引導Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計這2種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA，足以引導Cas9蛋白對DNA的定點切割[18]。當Cas9酶剪切基因組DNA 時，可以在 protospacer-adjacent motif（PAM）序列前產生一個雙鏈切口（double-strand break?ers，DSBs），由于細胞基因組具有自我修復功能，通過非同源末端連接（nonhomologous end-joining，NHEJ）方式可以使基因組發生隨機的插入-刪除（insertion and deletion，INDEL）效應[19]。當細胞內有基因組同源臂序列存在時，基因組會進行同源修復（homology-directed repair，HDR），從而實現對基因組任意位點的序列編輯[20]。

作為一種RNA導向的雙鏈DNA（dsDNA）結合蛋白，Cas9效應物核酸酶能夠共定位RNA、DNA和蛋白，因此擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的 Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表達適當的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可連接到目標DNA，不影響Cas9的結合。對動物體細胞或受精卵導入Cas9蛋白的mRNA，以及靶向特定序列的sgRNA，即可實現動物體內基因的失活或缺陷基因的修復[21]。Cas9蛋白能在任何dsDNA序列處帶來融合蛋白及RNA，這為生物體的改造和研究帶來巨大潛力。

2 CRISPR-Cas9技術構建實驗動物腫瘤模型的應用進展

相較于傳統的實驗動物腫瘤模型構建模式，CRISPR-Cas9技術在構建動物模型上的應用主要有2條途徑：①應用CRISPR-Cas9技術編輯細胞內的一個或多個基因，之后應用基因編輯后的腫瘤細胞建立移植型實驗動物腫瘤模型，分析腫瘤表型與基因之間的關系；②動物尾靜脈注射CRISPR-Cas9系統或者在動物組織注射病毒包裹的CRISPR-Cas9系統，實現動物體細胞或組織特異性的基因編輯，從而建立實驗動物腫瘤模型[22]。

2.1 構建實驗動物肝癌模型

利用小鼠模型對腫瘤相關基因的研究，傳統的ZFN和TELEN技術是在受精卵水平上進行基因編輯，然后將編輯后的受精卵培養為成鼠[23]。2014年，美國麻省理工學院Jacks教授領導的團隊首次報道了利用CRISPR-Cas9技術在小鼠肝細胞直接引入腫瘤基因突變來誘導腫瘤形成并構建肝癌小鼠模型的新方法[24]。該團隊通過尾靜脈高壓注射技術，將表達Cas9和sgRNAs的CRISPR質粒導入小鼠肝臟，它們結合后可以靶向腫瘤抑制基因Pten和p53（又稱TP53和Trp53）。CRISPR介導的Pten突變致使小鼠肝細胞內Akt的磷酸化水平提高，以及過多的脂質在肝細胞內囤積，這與使用Cre-LoxP基因敲除技術構建的小鼠肝癌模型的表型相同。同時靶向Pten和p53，誘發了肝臟腫瘤，也與通過Cre-LoxP介導的Pten和p53雙基因敲除的效果一致。小鼠肝臟和腫瘤組織的DNA測序結果表明，腫瘤細胞內存在抑癌基因Pten和p53的雙等位基因插入或缺失突變。此外，研究者們利用CRISPR系統，在尾靜脈注射靶向β-catenin基因的sgRNA，同時還注射了帶有同源臂的模板序列，在小鼠肝組織中將重要的腫瘤相關基因β-catenin實現了點突變，進而導致肝細胞內發生點突變后的β-catenin蛋白發生核移位的，最終導致小鼠肝臟的癌變。這項研究闡述了用CRISPR/Cas系統直接突變抑癌基因和原癌基因的可行性，提供了一種實驗動物肝癌模型構建的新方法，也為功能基因組學研究提供了新的途徑。通過這項實驗，科研人員首次利用CRISPRCas9技術在成年小鼠肝臟內進行抑癌基因和原癌基因的編輯。CRISPR-Cas9技術避開了傳統基因編輯技術在胚胎干細胞上進行的編輯，以及飼養雜合體小鼠的繁瑣過程，能夠大大降低實驗成本，節省實驗時間，提高實驗效率。

2.2 構建實驗動物結直腸癌模型

結直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，在西方國家和我國均有很高的發病率。在結直腸癌患者的腫瘤樣本中，TP53、MAPK、TGF-β及PI3K通路的基因有多發性基因突變現象，但這些基因在腫瘤發生發展過程中的具體作用仍不十分明確[25]。Matano等將多基因編輯建立實驗動物腫瘤模型的理念應用到腸癌研究中，建立了源自正常腸道上皮的結直腸癌類器官[26]。應用CRIS?PR-Cas9技術對抑癌基因 TP53、APC、SMAD4，以及癌基因PIK3CA和KRAS進行基因突變，發現表達全部5種基因突變的結直腸癌類器官都出現了明顯的腫瘤樣變化，在體外不依賴于干細胞巢的因子就能快速生長，進一步在裸鼠腎包膜下移植癌細胞會形成腫瘤。研究表明，激活通路突變即可在腫瘤微環境中維持腫瘤干細胞特性，但腸癌細胞的侵襲性行為還需要細胞內有更多的分子出現損傷。這項研究揭示了多基因突變對腫瘤發生的協同作用，是一種新的腫瘤研究思路。

2.3 構建實驗動物肺癌模型

CRISPR-Cas9是一項多功能的用于研究遺傳元件功能的基因組編輯技術。為使Cas9在體內得到更加廣泛的應用，張峰團隊構建了一種Cas9蛋白條件性表達的小鼠模型，有效克服了向成鼠體內導入Cas9的困難，簡化了體內進行基因編輯的步驟，提高了編輯效率[27]。隨后，分別在體內及體外進行基因組編輯，利用腺相關病毒（AAV）、慢病毒及納米顆粒介導的形式在神經元、免疫細胞、內皮細胞中導入sgRNA。利用這些Cas9小鼠，他們選擇了肺腺癌中3個突變最顯著的基因KRAS、p53和LKB1，用AAV載體向Cas9小鼠中導入p53和LKB1基因的sgDNA，通過同源重組介導的修復引入KRASG12D基因突變，基因突變后的小鼠肺組織中出現了明顯的腫瘤結節，且隨著時間的延長瘤體顯著增大，應用全新的方法成功構建了小鼠的肺癌模型。該研究建立的小鼠腫瘤模型與傳統的遺傳改變小鼠腫瘤模型相比，不僅實現了特定組織的多基因敲除，而且是多基因共同作用對肺癌表型影響的模型，可以更加準確地反應腫瘤發生的分子機制和腫瘤的表型。同時，這一研究成果證實了Cas9條件性表達小鼠在基因組編輯和癌癥建模中可以廣泛應用。目前，Cas9小鼠模型已被該科研團隊提供給全世界多家實驗室，人們正在利用該小鼠模型進行基因組學的研究。

在非小細胞肺癌中，腫瘤細胞的2號染色體發生斷裂，基因易位會導致EML4與ALK基因發生基因融合。EML4-ALK融合基因在細胞惡性轉化過程中具有潛在的致癌作用，是染色體重排發生基因融合對腫瘤發生發揮重要作用的經典例子[28]。Maddalo等用CRISPR技術在腫瘤細胞中表達EML4-ALK融合基因，建立了具有ALK+人類非小細胞肺癌典型的分子特征和病理特征的實驗動物模型[29]。與基因打靶技術構建的實驗動物腫瘤模型相比，這項實驗技術成本更低，速度更快。

此外，Sanchez-Rivera等在肺癌的研究中也采用了多基因編輯技術，他們把表達CRISPR系統的慢病毒注入小鼠肺組織，構建條件性表達Kras癌基因的小鼠肺癌模型；采用CRISPR技術靶向不同基因（Pten，Nkx2-1），通過表型分析研究每個基因與Kras癌基因的協同對腫瘤發生的影響[30]。

2.4 構建實驗動物宮頸癌模型

宮頸癌又稱宮頸浸潤癌，是最常見的婦科惡性腫瘤，高危性人乳頭瘤病毒（HPV）癌基因（E6和E7）表達異常是宮頸癌發病的重要原因[31]。Zhen等基于CRISPR-Cas9技術建立了靶向編輯E6、E7基因的編輯系統，并將該系統轉染HPV-16陽性的宮頸癌SiHa細胞株。結果表明，利用CRISPR-Cas9系統進行E6、E7基因及其啟動子的編輯后，會導致p21和p53蛋白在宮頸癌細胞內的積累，從而顯著降低細胞在體外的增殖能力。隨后，研究人員通過裸鼠皮下接種腫瘤細胞的實驗，構建了皮下宮頸癌移植瘤的動物模型。研究發現，經CRISPR-Cas9技術靶向編輯E6、E7基因后的腫瘤細胞接種的小鼠體內，腫瘤的生長受到明顯抑制[32]。這為CRISPR-Cas9技術在靶向編輯高危性HPV致癌基因的基因治療中的應用提供了實驗依據。

2.5 構建實驗動物白血病模型

白血病，也稱為血癌，是一種造血干細胞異常的克隆性惡性疾病。染色體易位在白血病患者體內較為常見，在研究白血病發病的初始機制時，需要一種有效的方法以精確重現這種腫瘤相關的染色體易位。急性粒細胞性白血病中ETO和RUNX1基因融合的現象比較常見，Torres等利用sgRNA介導的CRISPR-Cas9系統構建了這種腫瘤相關的染色體易位，在人類細胞系和原代細胞中模擬出與急性骨髓性白血病高度一致的染色體重排模型，這些研究展示了CRISPR-Cas9技術的精確度和可靠性，為染色體易位相關腫瘤的研究提供了有力工具[33]。再如，獲得性和先天性的7號染色體長臂缺失，常見于癥急性粒細胞白血病和骨髓異常增生綜合征，而且往往預示與預后不良相關[34]，但是對定位于人類7號染色體長臂上的相關抑癌基因的功能研究目前尚不明確。組蛋白H3K4三甲基化轉移酶（MLL3）由7號染色體上的一個抑癌基因編碼，屬于MLL蛋白家族，可以甲基化H3K4位置的賴氨酸，從而調控下游相關基因的轉錄水平[35]。目前，已經發現該基因在白血病、乳腺癌、結腸癌、髓母細胞瘤等細胞中廣泛存在及表達[36-37]。Chen等利用CRISPR-Cas9技術對MLL3基因進行編輯，并獲得了該基因表達水平下調至野生型50％水平的小鼠模型[38]。在此基礎上，配合其他因7號染色體長臂缺失導致的事件，最終促進白血病的發生。通過這種方法構建的小鼠白血病模型證實了MLL3基因是7號染色體長臂上的一個單倍劑量不足的抑癌基因，并且為白血病的基因治療提供了新的策略。

對腫瘤基因組測序的結果提示，在人類惡性腫瘤的發生發展過程中，往往存在4個甚至更多基因的突變，但是利用傳統的實驗動物模型育種方法很難模擬出這種基因突變的復雜性。2014年，美國哈佛醫學院的Heckl等報道，利用CRIS?PR-Cas9基因編輯技術克服了這一限制[39]。他們將sgRNA和Cas9共同導入同一只小鼠的造血干細胞，對其中多個基因（Tet2、Runx1、Dnmt3a、Nf1）同時進行基因編輯，發生基因突變的細胞出現了明顯的惡性髓系血液病的表型變化。因此而獲得的急性粒細胞白血病模型小鼠能夠與白血病患者中出現的轉錄因子、信號通路相關的細胞因子等基因突變相匹配。這項研究結果顯示，利用慢病毒轉導sgRNA和Cas9的系統進行編輯，能夠用于體內多基因突變腫瘤模型的構建，從而更好地模擬人類腫瘤的復雜性。

2.6 構建實驗動物腦瘤模型

傳統的腦瘤動物模型具有多種缺陷。例如，基于細胞系建立的異源移植腫瘤（CDX）模型的細胞主要是高等級來源，并且這種模型不能全面地模擬腦瘤的不同等級。傳統的遺傳工程小鼠模型（GEMM），其生成是一個低效和耗時的過程。CRISPR-Cas9系統作為一種新的工具，可以克服現有方法的不足[40]。它能夠準確有效地在一個選擇的DNA位點獲得靶基因組的遺傳突變。在中樞神經系統中，已成功地利用CRISPR基因敲除技術構建了髓母細胞瘤和膠質母細胞瘤的動物模型[41-42]，也確定了與腦瘤病因密切相關的一些調節因子（p53、Nf1、Pten、Ptch1、Bmi1、Met、Notch1、CDK6、miR-10b、TERT、LSD1、miR-218 、miR-128）[43]。研究發現，多個腫瘤相關基因（包括p53、Nf1、Pten和 Ptch1）通過 CRISPR-Cas9技術造成缺失，可誘導腦瘤的形成[44]。這些研究均提示，可以利用CRISPR-Cas9系統，操縱與腦瘤生成相關的其他調節因子，快速有效地構建基于遺傳改變的腦瘤模型，為研究腦瘤發生與基因突變之間的關系提供了有力工具。

3 結語

惡性腫瘤一直是威脅人類健康和生命的重大疾病，也是當前生命科學和醫學研究的熱點。腫瘤的發生和發展涉及多條信號通路，是一個多基因共同參與且緩慢持續的過程[45]。構建實驗動物腫瘤模型是腫瘤研究中常用的方法[46]。研究腫瘤相關基因的功能，需要在細胞不同的分化階段，或在動物體內外對不同的基因進行有效干擾或敲除，并以此為基礎研究腫瘤發生發展過程與基因的關系[47]。相較于傳統的轉基因技術和基因敲除技術，CRISPR-Cas9技術具有設計簡單和操作方便的優點，科學家們將CRISPR系統創造性地應用于惡性腫瘤的研究，構建了許多實驗動物腫瘤模型。CRISPR系統作為一種快速且有效的基因編輯工具，已被用于細菌、植物、無脊椎動物、哺乳動物和人類細胞，幾乎沒有物種限制[48]。值得一提的是，河北科技大學的韓春雨團隊最近報道，他們開發出了一種基于NgAgo DNA單鏈引導的基因編輯工具，為哺乳動物基因組編輯提供了另一種手段[49]。相較于已經較為成熟的CRIS?PR技術，NgAgo技術尚處于起步階段，其應用價值有待于后續科學研究的摸索和驗證。

目前，CRISPR-Cas9基因編輯技術正勢如破竹地攻克著腫瘤研究領域的一個個難題，不僅豐富了腫瘤研究的技術手段，而且提供了腫瘤研究的新視角和新思路。可以預見的是，CRISPRCas9技術將快速融入腫瘤細胞分子生物學研究中，可以幫助科學家們精準且快速地進行動物體基因組的編輯，構建基因突變和基因敲除的實驗動物腫瘤模型，為腫瘤相關基因的全面研究以及腫瘤的基因治療奠定基礎[50]。

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Application Progress of CRISPR-Cas9 Gene Editing Tech?nology in Constructing Experimental Animal Tumor Models

XIONG Wei1,2*,YANG Yong-Qin1,ZI Jia-Ji1,SUN Mei-Tao1,MEI Wen1,ZUO Shao-Yuan1,ZHANG Xiao-Juan3
1.College of Basic Medical Sciences,Dali University,Dali 671000;2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Ento?mological Biopharmaceutical R&D,Dali 671000;3.Dali First People's Hospital,Dali 671000;China
*Corresponding author,E-mail:xwailp@163.com

The CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nucle?ase 9） genome editing technology is a new type of gene editing technology based on the immune mechanism of ar?chaea resisting the invasion of exogenous nucleic acid.Compared with zinc-finger nucleases（ZFN）,gene targeting in embryonic stem（ES） cells and transcription activator-like effector nucleases（TALEN） technology,CRISPR-Cas9 system is more efficient,simply to operate,and less cytotoxic.Moreover,it has been widely used in genome edit?ing in multiple species and related tumor research,including research on constructing experimental animal tumor models.In this paper,we are aimed to summarize the research status and application progress of the the CRISPRCas9 system in constructing experimental animal tumor models.

CRISPR-Cas9;gene editing;tumor;application progress

Q78;R730

A

1009-0002（2017）04-0551-07

2016-11-10

國家自然科學基金（81560458，31601155）；云南省教育廳科學研究基金重點項目（2014Z126）；大理大學博士科研啟動基金（BSKY2012018）；大理大學大學生創新創業計劃（X-CXCY-2016-13）

熊偉（1982-），男，副教授，博士，碩士生導師

熊偉，（E-mail）xwailp@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.030