納米熒光生物傳感器研究進展及應用

馮婷婷

（山西中醫藥大學，山西晉中030619）

納米熒光生物傳感器研究進展及應用

馮婷婷

（山西中醫藥大學，山西晉中030619）

傳統熒光生物傳感器存在檢測能力不強、穩定性差的問題，使得生物傳感器的推廣、使用受限。納米技術的出現促進了熒光傳感器的發展，使納米熒光生物傳感器的檢測能力大大提升，具備高靈敏度、反應靈敏、專一性強、檢測程序簡單等特點，因此近年來納米熒光生物傳感技術發展迅猛。本文分別概述了納米熒光生物傳感器的分類及特點，通過現有的科研成果展示了當前納米熒光生物傳感器的技術發展水平，著重分析并比較了當前生物傳感器存在的關鍵問題。結合近年來納米技術科研水平的提升，基于納米技術設計的納米熒光生物傳感器體系在設計、制備、空間結構、性質及實用性方面的綜合提升作用，為新型選擇性檢測、定向檢測提供了解決途徑并展望了未來納米熒光生物傳感器的發展方向及前景。

納米技術；熒光生物傳感器；生物探針

1 納米熒光生物傳感器發展歷程

生物傳感器的概念始于20世紀60年代，直到80年代，全面而深入的研究才得以開展，在初始階段的研究取得了豐碩成果，在生物酶、DNA、Hg+有毒重金屬離子等的檢測有著大量實踐。生物傳感器作為一種檢測手段，檢測對象一般為生物酶、DNA、抗原/抗體、細菌等活性物質，以此作為識別對象的一類傳感器[1]。由于生物傳感器有著比傳統檢測手段更高的靈敏度、更短的響應時間、更直觀的檢測結果，現已被深度開發，廣泛應用于生命科學科研工作、臨床醫學、微生物學研究、環境監測治理、司法鑒定等。但由于材料科學水平的限制、制備技術的不成熟、科研體系建立的不完善，導致了當時生物傳感器的響應檢出能力并不理想，不能完全滿足生物醫學等其他學科的需求。隨著掃描電鏡、透射電鏡技術的發展，納米技術在20世紀90年代呈現出爆發式增長，也間接促進納米生物傳感器的進步。由于材料尺寸達到納米級別時，一般具備小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應、介電限域效應及宏觀量子隧道效應等特征，使得比表面積顯著增大、表面能增加，材料表面的物理化學性質發生根本改變。促進了各學科的進步，延伸的研究領域十分廣泛，如納米光催化技術、鋰電池技術、傳統金屬加工技術等。其中生物傳感器輔予納米技術為傳感器的突破式發展提供了可行的方案，現有的研究成果中，各體系類型的納米生物傳感器已被深入研究。

2 納米熒光生物傳感器分類

納米熒光生物傳感器是在納米技術的手段下，以納米材料為主要載體，來作為新型生物傳感器傳輸介質，檢測識別物質一般為酶、抗原/抗體、核酸、脂質體、細胞、微生物等生物敏感性物質，并以釋放的熒光信號作為檢測對象的分析體系。針對納米熒光生物傳感器中納米材料的功能來劃分，可分為納米熒光生物傳感器、納米光纖熒光生物傳感器及納米光纖免疫生物傳感器等。

3 納米熒光生物傳感器

傳統熒光方法是采用有熒光效應的染料標記被檢物體，這種標記方法操作復雜，操作者的技術水平直接影響著標記的效果。標記成功率低，熒光強度低以至于難于檢測發現；檢測背景復雜，對結果觀察造成干擾，會產生非相關顯示。采用納米技術制備的生物傳感器與目標物質有選擇性結合的效果，可以克服傳統熒光染料標記技術的缺點，能夠保證標記的成功率，獲得的檢測熒光信號強，便于檢測設備觀察，對靈敏度、可靠性上有著明顯的提升作用，為生物醫學領域中探究特定物質提供可靠的技術手段，其應用前景較好。目前，常見的納米熒光生物傳感器類型有量子點類、包封熒光分子類、稀土及稀土配合物類等。

3.1 量子點熒光生物傳感器

量子點納米顆粒一般由Ⅱ-Ⅵ（如CdSe，ZnS）、Ⅲ-Ⅴ族（如GaAs，InP）及Ⅳ-Ⅵ族（如PbS，PbSe）元素組成，目前研究最為深入的量子點體系為CdX（X=S、Se、Te）系列。量子點由于特殊的結構尺寸（1～10nm），有著優良的熒光特性，即高熒光量子產率、耐光漂白、相對狹窄而對稱的發射光譜和大范圍的連續激發光譜以及長熒光壽命等，由于量子點的優良熒光特性，使得量子點處理方式在生物傳感器中應用較普遍。相較于熒光染料，量子點產生的熒光強度、穩定性、發光壽命均有明顯優勢，特別適用于長時間的實時監測研究[2]。

針對體外游離物質的檢測對象，Meng團隊采用膽堿氧化酶、乙酰膽堿與量子點相結合的方式，使最終的符合體系在量子效應的作用下，對有機磷農藥的檢測有較好的特異選擇性，檢測靈敏度更高、體系穩定性好、對外部環境的耐受性大大增強，能夠線性響應的濃度范圍明顯增強，上述特征使得膽堿類-量子點體系在有機磷農藥的檢測分析實用性上大大提升[3]。在水體氰離子監測領域，Noipa團隊設計了高選擇性的納米熒光生物傳感器體系，利用CdS量子點自發熒光的特點，用半胱氨酸分子表面吸附處理，由于表面半胱氨酸與銅離子特異性的結合并發生明顯的熒光猝滅現象，與氰離子發生熒光恢復現象[4]。半胱氨酸-量子點體系保證了觀察背景的高對比度；進一步研究證實，熒光恢復程度與氰離子濃度成線性關系，可直接定量氰離子濃度。

以上述針對體外監測對象現有的量子點熒光傳感器體系不同，體內納米生物傳感器還應具備良好的滲透能力、定向靶標能力、可操作性及易分離等特性。為達到體內物質檢測的需求，具有磁特性的納米材料被引入生物傳感器領域，使其具備精準的定向靶標能力、可操作性及良好的分離效果，減少對生物體的影響及殘留，在生物醫學領域應用廣泛。謝敏等將量子點基底材料與磁性納米三氧化二鐵作為核結構，將苯乙烯、丙烯酰胺的共聚體吸附于量子點-磁性材料表面，改善表面理化性質，增加該復合體系的生物相容性，也為后續表面改性提供修飾位點[5]。該團隊將麥胚凝集素、花生凝集素、雙花扁豆凝集素嫁接于共聚體表面，制備了功能多樣的磁性納米熒光生物傳感器、該體系實驗證實，對細胞的糖蛋白組分有較好的檢測能力。

3.2 包封熒光分子類生物傳感器

包封熒光分子類生物傳感器將熒光染料、量子點等物質封裝起來，保證了熒光物質的穩定性，使其具備良好的穩定性及強熒光效應。Si團隊鈣離子熒光染料與多孔惰性的聚丙烯酰胺納米粒子在超聲的環境下，組裝為包封熒光分子生物傳感器[6]。基于聚丙烯酰胺良好的穩定性及表面游離化學鍵的作用，該體系對熒光染料的保護作用明顯，染料熒光強度衰減緩慢，而且提升了生物傳感器與胞內蛋白質特異性結合的概率，對細胞內游離的低濃度金屬離子檢出作用明顯。包封熒光分子類的生物傳感器在生理毒性上較量子點小，對人體健康影響微弱，故包封類生物傳感器在生物醫學監測領域有明顯優勢，是生物醫學研究的常用手段。

3.3 稀土及稀土配合物類生物傳感器

無機納米稀土離子存在著吸收能力強、轉換效率高、發射能力強、激發范圍廣、性質穩定、易觀察等特點，有利于在生物分析的發光無標記。陳團隊制備了氨基功能化的KGdF4：（Eu3+、Tb3+、Dy3+）磁性-熒光雙功能多色納米粒子，在免疫分析中應用廣泛；但稀土配合物的理化性質變化較大，發射的能量范圍窄、斯托克斯位移大、熒光強度穩定、壽命長等性質，相較于納米稀土離子體系，經配合物修飾后，制成的熒光生物傳感器檢出能力更強、更易于觀察及判定[7]。Pihlasalo巧妙運用Eu離子、Eu離子納米化螯合物在pH調節過程中，熒光強度的改變曲線，可準確測量樣品中蛋白質的等電點，其檢測限相較于傳統的電場法所需濃度更低、響應更靈敏。Harma團隊在采用均相時間分辨熒光共振能量轉移法時，將Eu3+螯合物修飾的納米粒子負載于聚苯乙烯表面，進攻蛋白質、量子點核殼結構，能快速、準確檢測出牛血清蛋白，最低檢測限下探至10ng，這種方法于生物實驗室的常規蛋白質的定量分析的應用潛力較大。

4 納米光纖熒光生物傳感器

納米光纖熒光生物傳感器發展較為迅速，它具有體積小、熒光分析特異性強、靈敏度高、抗電磁干擾能力強、信息容量大等諸多特點。Kopelman于20世紀90年代設計了應用于熒光標記檢測的納米光纖傳感器體系，在微環境pH值的檢測領域最早應用。在提高靈敏度、小型化的探究上做了進一步研究：在做DNA分子探究實驗時引入納米金顆粒子，靈敏度高、選擇性好、成本低、易用性和快捷的便攜式傳感器比其他DNA檢測手段的優勢明顯。采用表面等離子效應帶來的影響，開發出適用于Cd離子定量檢測的納米光纖傳感器，金納米顆粒與植物絡合素及肽鏈交聯而成，檢測限達到了0.16 ppb級別。納米光纖熒光生物傳感器具有無需參比電極，使用簡便、體積微小、速度快、可進行遠距離實時分析等諸多優點，具有廣泛的應用前景。

5 納米光纖免疫生物傳感器

為提高生物傳感器與目標物質的結合特異性，將光學、光子學理論引入免疫學領域，利用抗原-抗體特異性結合的特點，將抗原、抗體結合的光學變化量檢測、記錄下來，并采用納米處理技術設計的一類生物傳感器。兼具傳統免疫反應特異性及傳感器熒光標記的能力，廣泛應用于單細胞內部檢測、監測試驗。將20nm的蛋白與金納米顆粒結合，在局部表面等離子效益的作用下，來探究體內抗原-抗體的作用機理，對血清中前列腺特異性抗原有較強的特異選擇性。

6 展望

結合納米技術帶來的優勢，使得傳統生物傳感器能夠保持/獲得熒光特性，大大提升了檢測信號的強度及持久性；由于納米化處理使得生物傳感器比表面積顯著提升，為化學基團表面改性提供結合位點，為選擇性檢測有毒金屬離子、細胞內酶/蛋白質、抗原/抗體提供解決方案，前期研究已取得豐碩成果。但進一步提升納米熒光生物傳感器的靈敏度、選擇性、生物相容性及檢測范圍仍是當前研究熱點。特別對于細胞內活性物質檢測的生物傳感器的研究中，如何快速滲入、靶向結合、可控分離是限制細胞內生物傳感器廣泛使用的重要因數。因此開發新型納米熒光生物傳感器，在檢出能力、檢測種類、細胞內檢測上有明顯提升是未來研究的主要方向。

[1]Gao ZQ,Agarwal A,Trigg AD,et al.Silicon nanowire arrays for labelfree detection of DNA[J].Anal Chem,2007,79(9):3291-3297.

[2]Dahan M.Time-gated biological imaging by use of colloidal quantum dots[J].Optics Lett,2001,26(11):825-827.

[3]余濤,應天翼.量子點生物傳感體系用于膽堿酯酶抑制劑檢測的研究進展[J].生物技術通訊,2012,23(2):280-283.

[4]Noipa T,Tuntulani T,Ngeontae W.Cu2+-modulated cysteamine-capped Cd S quantum dots as a turn-on fluorescence sensor for cyanide recognition[J].Talanta,2013,105:320-326.

[5]謝敏,胡軍,龍炎民,等.凝集素修飾的三功能納米生物傳感器用于測定細胞表面糖綴合物[J].生物電子,2009,24(5):1311-1317.

[6]Si D,Epstein T,Lee Y E,et al.Nanoparticle PEBBLE sensors for quantitative nanomolar imaging of intracellular free calcium ions[J].Anal Chem,2012,84(2):978-986.

Research Progress and Application of Nanometer Fluorescence Biosensor

Feng Ting-ting
(Shanxi University of Traditional Chinese medicine,Shanxi Jinzhong 030619)

Traditional fluorescent biosensor has the problem of low detection ability and poor stability which makes the promotion and use of biosensor limited.The emergence of nano-technology has promoted the development of fluorescence sensor,greatly enhanced the detection ability of nano-fluorescent biosensor and has high sensitivity,responsive,specificity and simple detection procedure.Therefore,nanometer fluorescence biosensor technology has developed swiftly in recent years.In this paper,the general classification and characteristics of nano-fluorescence biosensors are summarized and the current development of nano-fluorescent biosensors is demonstrated by the existing research results.The key issues of the current biosensor are analyzed and compared.The nano-fluorescence biosensor system based on nano-technology is designed to improve the level of nanotechnology research in the design,preparation,spatial structure,nature and practicability.It provides a solution for the new selective detection and orientation detection.And the future development direction and prospect of nanometer fluorescence biosensor are prospected.

Nanotechnology;Fluorescence biosensor;Biological probe

TP212.3 文獻標志碼：A

2096-0387（2017）06-0078-04

馮婷婷（1985—），女，山西長治人，博士，講師，研究方向：納米材料的制備用于生物傳感分析、熒光探針的合成及其生物應用、用于細胞中酶的檢測等。