鼠神經生長因子生物學活性測定方法的研究

趙淑媛，曾娟梅，扈會平

1.珠海市麗珠單抗生物技術有限公司質量部，廣東珠海 519000；2.麗珠集團麗珠制藥廠QC部，廣東珠海 519000；3.麗珠集團麗珠制藥廠技術部，廣東珠海 519000

鼠神經生長因子生物學活性測定方法的研究

趙淑媛1，曾娟梅2，扈會平3

1.珠海市麗珠單抗生物技術有限公司質量部，廣東珠海 519000；2.麗珠集團麗珠制藥廠QC部，廣東珠海 519000；3.麗珠集團麗珠制藥廠技術部，廣東珠海 519000

目的 建立一個簡單、穩定、重復性好的雞胚背根神經節培養法測定mNGF活性的實驗方法。方法 通過對雞胚運輸溫度控制、神經節分離和接種時間限制、培養結果觀察時間摸索、活性測定的濃度范圍、重復性等試驗，建立了鼠神經生長因子生物學活性的測定方法。 結果 該方法具有操作簡便，靈敏度高、重復性好、測試結果準確的特點。結論 采用雞胚背根神經節培養法可有效測定鼠神經生長因子的生物學活性。

鼠神經生長因子；mNGF；雞胚背根神經節；生物學活性測定

神經生長因子（nerve gowth factor，NGF）是神經系統最重要的生物活性分子之一，能夠促進神經元的分化，維持神經元的存活[1]。鼠神經生長因子mNGF是一種從小鼠頜下腺分離出來的非共價鍵連接的多聚體蛋白。其生物學活性表現在能維持神經節細胞存活、誘導外周神經節外周突起生長[2]。鼠神經生長因子的生物學活性測定是其結構和功能研究的基礎。目前,國際上用于NGF活性測定的方法主要有2種,即雞胚背根神經節培養法和PC12細胞(Pheochromocytoma cells,大鼠腎上腺嗜鉻細胞)培養法[3-4]。由于細胞培養法對操作人員的經驗、細胞庫管理、細胞培養環境、檢測儀器等方面要求較高且設備設施投入大，故國內神經生長因子生物學活性測定的方法還是主要以雞胚背根神經節培養法為主。但是雞胚背根神經節培養法也存在干擾因素多，實驗結果重復性較差的現象，故該文通過對雞胚運輸溫度控制、神經節分離和接種時間限制、培養結果觀察時間摸索、活性測定的濃度范圍、重復性等試驗，建立了一個簡單、穩定、重復性好的鼠神經生長因子生物學活性的測定方法，有效地為鼠神經生長因子的生產過程監控和產品質量判定提供依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

CO2培養箱，解剖顯微鏡，超凈工作臺、，倒置顯微鏡等。

1.2 試劑

雞胚：購于珠海東坑雞場的石歧雞種蛋；鼠神經生長因子樣品：麗珠集團麗珠制藥廠自制；鼠神經生長因子標準品：來自中國藥品生物制品檢定所，1 000 Au/支；DMEM：購于INVITROGEN公司；鼠尾膠：麗珠集團麗珠制藥廠自制。

2 實驗方法

2.1 鼠尾膠原的涂布

取自制鼠尾膠原均勻涂布于培養瓶中。將殘留液吸盡后，于37℃生化培養箱中干燥。在接種神經節前，培養瓶先用DMEM培養基浸洗，接種前將DMEM培養基倒盡。

2.2 DMEM培養基配制

取DMEM 1包，加葡萄糖0.60 g，L-谷氨酰胺0.02 g，1.5MHEAPS溶液1 mL加純化水溶解，加青霉素1 000 U、鏈霉素10 000U，用碳酸氫鈉調節pH=7.0后定容至1 000 mL，無菌過濾使用。

2.3 雞胚背根神經節的分離和接種

取孵育7～9 d雞蛋，于超凈臺中，取出雞胚置于無菌培養皿中。于解剖顯微鏡下，從脊柱兩側分離出背根神經節，接種置培養瓶中。每瓶至少3個，于CO2培養箱中，37℃、5%CO2條件下溫育至少1 h。

2.4 實驗與培養

樣品組（共6個培養瓶）每瓶分別加入含逐級3倍稀釋的不同終濃度鼠神經生長因子的DMEM培養基各3 mL；標準品組（共5個培養瓶）每瓶分別加入含逐級3倍稀釋的不同終濃度鼠神經生長因子標準品的DMEM培養基各3 mL；陰性對照組加入DMEM培養基3 mL。將培養瓶放入CO2培養箱中，37℃、5%CO2條件下培養24 h。

2.5 結果觀察

在倒置顯微鏡下觀察，用電子目鏡拍攝。依神經節突起生長不同程度分為5個等級。神經節突起生長4個象限、呈樹杈狀為“++++”；神經節突起生長3個象限、呈樹杈狀為 “+++”；神經節突起生長 2個象限者為“++”；神經節突起只有幾根生長者為“+”；無突起生長者為“-”。

2.6 結果判定及校正

2.6.1 結果判定 以神經節突起生長為“++++”時的樣品稀釋倍數計算效價（AU/mL）。

3 實驗結果與討論

3.1 雞胚運輸溫度條件實驗

由于溫度變化對雞胚的生長發育有較大的影響，在氣溫較低的冬季，將種蛋分別用普通紙皮運輸箱和采用保溫泡沫箱內加電暖寶裝置控制箱內溫度在37℃左右的包裝方式進行種蛋運輸。取不同包裝箱內的雞胚摘取神經節接種后加入1 AU/mL的mNGF溶液或DMEM培養基后，放入CO2培養箱培養24 h后進行觀察神經節的生長情況。結果見表1。

表1 雞胚運輸溫度條件實驗結果

實驗數據顯示，雞胚運輸過程中采取保溫泡沫箱內加電暖寶裝置控制運輸箱內溫度在37℃左右，可以保證運輸過程中雞胚不被凍傷，接種后神經節不會脫落或因受傷神經節生長狀態不好，造成實驗結果差異較大。

3.2 神經節分離和接種時間控制實驗

由于神經節需要在一定的溫度、濕度下才能正常生長、發育。為保證神經節的生長成活率，進行了分離接種時間（神經節分離、接種到培養瓶放入CO2培養箱中）長短，對神經節的生長成活率的影響實驗。取神經節接種后加入1 AU/mL的mNGF溶液后，放入CO2培養箱培養24 h后觀察神經節的生長的存活率情況。結果見表2。

表2 神經節分離和接種時間控制實驗結果

經過多次實驗，觀察到由于接種時間太長會造成神經節生長緩慢或因凍傷或失水而死亡，從而造成活性檢測時出現樣品無活性或無梯度等情況。認為保證在30 min內完成神經節分離、接種并進行溫育，是本實驗的關鍵步驟。對于在冬季氣溫較低的條件下進行mNGF活性檢測；雞胚背根神經節分離接種操作不熟練者；或同時進行多批次檢品檢測需接種較多培養瓶時時間控制顯得尤其重要。因此，為保證神經節的成活率應將接種后的培養瓶及時放入CO2培養箱中進行溫育。

3.3 培養結果觀察時間摸索實驗

由于神經節的培養時間不同，其生長狀況不一樣。通過不同培養時間下對實驗結果的觀察，認為培養24～36 h為觀察結果的最佳時間。培養時間＜24 h，神經節的生長狀況未到達最佳狀況，并且常常會因為培養瓶的反復移動造成神經節突起貼壁不牢固而出現回卷、包節的現象，以至于影響結果判斷。培養時間＞48 h，神經節的突起生長會變得更細、更長，出現活性梯度不明顯同時也會因為神經節自身的抽絲生長背景較高而干擾結果判定。

3.4 mNGF量效學關系實驗

采用雞胚背根神經節培養法，摸索不同濃度的mNGF或不同效價單位的mNGF對神經節的生長狀況的影響。結果見表3和圖1。

圖1 mNGF量效學關系實驗神經節生長狀況

表3 mNGF量效學關系實驗結果

利用雞胚背根神經節培養法，在培養24 h后觀察：在mNGF終濃度為0.1 ng/mL或0.03 AU/mL時，僅有少量神經節細胞突起生長為 “+”；在mNGF終濃度為10 ng/mL或1 AU/mL時，有大量神經節突起呈放射生長為“+++”或“++++”，其神經節突起生長狀況呈現出最好的狀態。在mNGF終濃度＞30 ng/mL或1AU/mL時，神經節突起生長受抑制為“+++”或“++”。

3.5 重復性測定

采用雞胚背根神經節培養法，對3批產品的生物學活性測定進行了重復實驗，檢測6次結果，CV值小于20%。實驗數據見表4。

表4 mNGF效價測定重復性測定實驗結果

4 結語

雞胚背根神經節培養法實驗條件要求簡單，易于開展，并且可以觀察到mNGF對神經節突起生長的促進作用。采用雞胚背根神經節培養法mNGF生物學活性測定時需控制雞胚37℃保溫運輸條件，并在30 min內完成神經節分離、接種溫育，培養24 h后進行結果觀察；且在mNGF的終濃度為0～30 ng/mL時，隨著mNGF的終濃度升高神經節突起生長增多、增長；在mNGF的終濃度高于100 ng/mL或3AU時，神經節突起生長變密、變短、生長受到抑制；而在不加mNGF時，神經節則無突起或僅有少量突起生長。通過控制上述實驗條件，該測定方法的CV值為%，因此，可采用雞胚背根神經節培養法，進行鼠神經生長因子生物學活性的限量或半定量測定。該方法適合生產過程中對mNGF原液和制劑的質量控制。

[1]柳川,李晉萍,華仲慰,等.小鼠頜下腺2.5S神經生長因子的純化與活性鑒定[J].軍事醫學科學院院刊，1987，11(1)：28-33.

[2]王國華,陳南春,惠宏襄,等.小鼠領下腺神經生長因子的制備和活性鑒定[J].第四軍醫大學學報，1998，19(6)：646-648. [3]徐天瑞,董躍偉,熊郁良.兩種測定神經生長因子活性方法的比較研究[J].藥物分析雜志，2000，20(1)：17-19.

[4]劉少平,楊國成,孟祥平,等.小鼠頜下腺2.5S神經生長因子生活學活性評估標準的建立[J].廣西醫學，2005，27(1)：50-51.

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10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.05.052

2016-11-15）

趙淑媛（1972.3-），女，湖南衡陽人，本科，制藥工程師，主要從事藥品質量控制與質量保證工作。