豆醬微生物宏蛋白質(zhì)組提取及分析

烏日娜，薛亞婷，張 平，唐筱揚(yáng)，陶冬冰，岳媛媛，張鵬飛，陳 衛(wèi)*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

豆醬微生物宏蛋白質(zhì)組提取及分析

烏日娜1,2，薛亞婷1，張 平1，唐筱揚(yáng)1，陶冬冰1，岳媛媛1，張鵬飛1，陳 衛(wèi)2,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

為了更進(jìn)一步探索豆醬中微生物群體的功能，實(shí)驗(yàn)利用分步提取法，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳，建立了豆醬微生物宏蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，并利用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，共鑒定出232 種蛋白質(zhì)，可歸為糖代謝60 種、核酸代謝57 種，蛋白質(zhì)代謝48 種，能量代謝15 種，脂質(zhì)代謝3 種，其他功能蛋白質(zhì)49 種。來(lái)源于細(xì)菌的蛋白質(zhì)數(shù)量幾乎為來(lái)源于真菌蛋白質(zhì)數(shù)量的3 倍，其中細(xì)菌來(lái)源以枯草芽孢桿菌、明串珠菌、糞腸球菌、腸膜明串珠菌和德氏保加利亞乳桿菌為主，真菌來(lái)源以釀酒酵母、裂殖酵母、鏈孢霉、白腐菌和棉阿舒囊霉為主。

豆醬；宏蛋白質(zhì)組；蛋白質(zhì)功能；微生物來(lái)源

豆醬營(yíng)養(yǎng)豐富、香氣馥郁，是東北很多家庭的必備食品，而且傳承著冬季做醬的傳統(tǒng)習(xí)俗。豆醬的品質(zhì)和風(fēng)味與其中的微生物組成密切相關(guān)，目前對(duì)豆醬中微生物研究已經(jīng)由純培養(yǎng)菌種特性研究，如乳酸菌[1-3]、酵母菌[4]、霉菌[5]等，轉(zhuǎn)向利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)、新一代測(cè)序技術(shù)等對(duì)其中微生物多樣性進(jìn)行研究[6-8]，例如Nam等[9]利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)韓國(guó)豆醬細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，提供豐富的物種組成信息。

宏蛋白質(zhì)組學(xué)的概念是在宏基因組學(xué)[10-11]概念的基礎(chǔ)上提出的，他們有著共同的優(yōu)點(diǎn)：將研究對(duì)象從單一微生物拓展到復(fù)雜的微生物群落，不再依賴于微生物培養(yǎng)[12-14]，但宏基因組學(xué)存在諸多限制：如DNA提取較困難，純度要求高，克隆表達(dá)效率低，需要篩選完整的功能基因組，構(gòu)建大片段的基因組文庫(kù)十分復(fù)雜[15]；重復(fù)基因和基因表達(dá)的時(shí)空特異性也為研究增加了阻礙。轉(zhuǎn)錄也面臨RNA易降解，萃取時(shí)產(chǎn)生的腐殖質(zhì)難消除，即使相似的基因在不同群落的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)也不同，RNA與相關(guān)蛋白質(zhì)合成關(guān)聯(lián)性低等問(wèn)題[16]。宏蛋白質(zhì)組學(xué)的興起很大程度上彌補(bǔ)了這些缺陷。其對(duì)于所研究微生物群體的限制性較小，鑒定蛋白質(zhì)時(shí)無(wú)需標(biāo)記，可通過(guò)反向遺傳學(xué)推測(cè)氨基酸序列獲得相應(yīng)的編碼基因信息，追蹤復(fù)雜環(huán)境中微生物群體的功能[17-18]，對(duì)宏基因組學(xué)起到補(bǔ)充作用，將宏基因組數(shù)據(jù)和自然環(huán)境的生物過(guò)程聯(lián)系在一起。宏蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白質(zhì)鑒定、種系發(fā)生以及微生物群體的功能性分析等方面都更具優(yōu)勢(shì)[19]。2004年Rodríguez-Valera[20]首次提出宏蛋白質(zhì)組的概念，是指復(fù)雜環(huán)境微生物群落中所有生物的蛋白質(zhì)組總和。孔令瓊等[21]利用該技術(shù)鑒定了黃酒麥曲浸提液中所有可溶性蛋白質(zhì)，為探索微生物與黃酒風(fēng)味之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。張武斌[22]利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)清香白酒生產(chǎn)常用的3 種大曲進(jìn)行分析，檢測(cè)到釀酒酵母合成的乙醇-O-酰基轉(zhuǎn)移酶，確認(rèn)其為清香白酒酯化功能菌。豆醬中微生物宏蛋白質(zhì)組還鮮有報(bào)道，它是指豆醬中所有微生物產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)。豆醬微生物宏蛋白質(zhì)組研究，可為發(fā)現(xiàn)功能蛋白質(zhì)標(biāo)記物、種系發(fā)生以及微生物群體的功能性分析提供依據(jù)，也為進(jìn)一步揭示微生物與豆醬品質(zhì)形成關(guān)系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

采集自遼寧省沈陽(yáng)市農(nóng)家利用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法制備的豆醬，用保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

丙烯酸胺、Tris、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、N,N-甲叉雙丙烯酞胺、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 美國(guó)Sigma公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、溴酚藍(lán)、3-（（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基）-1-丙磺酸（3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) propanesulfonate，CHAPS） 美國(guó)Bio-Rad公司；過(guò)硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、冰乙酸、無(wú)水乙醇、丙酮、考馬斯亮藍(lán)G-250 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

裂解液：稱取尿素8.408 1 g，硫脲3.044 8 g，CHAPS 0.8 g，蛋白質(zhì)酶抑制劑PMSF 0.003 5 g，DTT 0.2 g于20 mL容量瓶中，加入去離子水定容混勻，分裝至2 mL離心管，-20 ℃條件下保存。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5418R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；脫色搖床 上海華亭科學(xué)儀器廠；細(xì)胞超聲儀 上海豫明儀器有限公司；分析天平 榮華儀器有限公司；CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)、Mini電泳系統(tǒng)、電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VS-1型渦旋儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司；Cary 50紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物宏蛋白質(zhì)組的提取

1）樣品初步處理：取豆醬樣品70 g放于500 mL離心桶中，加入200 mL磷酸鹽緩沖液，放入直徑1 cm的玻璃珠30 顆，渦旋儀振蕩離心桶10 min。將玻璃珠取出，2 000 r/min離心20 min，取出上清液；沉淀中加入150 mL磷酸鹽緩沖液搖勻，2 000 r/min離心20 min，取上清液；將收集的所有上清液2 000 r/min離心20 min后，收集上清液，棄去沉淀。

2）收集菌體沉淀，提取蛋白質(zhì)：將所得上清液6 000 r/min離心20 min，將沉淀移至研缽中，利用液氮研磨輔助10% TCA/丙酮方法提取蛋白質(zhì)，得到蛋白質(zhì)粉末[23]。

3）上清液中提取蛋白質(zhì)：將6 000 r/min離心后所得的上清液12 000 r/min離心20 min，收集沉淀物，用5 mL磷酸鹽緩沖液清洗后12 000 r/min離心20 min收集沉淀物并轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，每管加入1.5 mL丙酮清洗沉淀，放入-20 ℃冰箱靜置2 h，12 000 r/min離心20 min，棄上清液，收集沉淀物，重復(fù)2 次，沉淀冰上風(fēng)干得到胞外蛋白質(zhì)粉末。

1.2.2 微生物宏蛋白質(zhì)組的裂解

分別取適量沉淀和上清液蛋白質(zhì)粉末于2 mL離心管中，按照0.1 g/mL加入裂解液，20%（26 W）功率超聲助溶20 min，工作2 s停3 s，12 000 r/min離心1 h，取上清液。

1.2.3 蛋白質(zhì)定量

配制10 mg/mL BSA母液，稀釋至1 mg/mL，按照Bradford微量蛋白質(zhì)測(cè)定法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度[20]。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)提取效果

利用SDS-PAGE對(duì)從豆醬中提取的微生物胞內(nèi)和胞外宏蛋白質(zhì)組進(jìn)行檢測(cè)。分離膠質(zhì)量濃度為12g/100mL，濃縮膠濃度為5g/100mL。電泳程序?yàn)椋?0 V，15 min； 120 V至電泳結(jié)束。

1.2.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定宏蛋白質(zhì)組

將電泳后的蛋白質(zhì)泳道切下，放入1.5 mL離心管中，加入1 mL滅菌的去離子水，利用LC-MS/MS進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定（北京華大蛋白質(zhì)研究公司），使用Mascot 2.3.01進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物宏蛋白質(zhì)組定量結(jié)果

豆醬中微生物胞內(nèi)宏蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)量濃度為5.45 mg/mL，胞外宏蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5.12 mg/mL。胞內(nèi)和胞外蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度均大于5 mg/mL，能夠滿足SDS-PAGE的需要。

2.2 SDS-PAGE結(jié)果

豆醬中微生物胞內(nèi)和胞外宏蛋白質(zhì)組的電泳結(jié)果如圖1所示，胞外蛋白質(zhì)條帶集中分布在15～40 kD以及70～120 kD之間，胞內(nèi)蛋白質(zhì)可見(jiàn)11 條較清晰的蛋白質(zhì)條帶，這些蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量在15～160 kD之間。在15～120 kD之間有8 條顏色較深的蛋白質(zhì)條帶，說(shuō)明在這個(gè)分子質(zhì)量區(qū)間的蛋白質(zhì)數(shù)量較多，在120～160 kD之間有3 條顏色較淺的蛋白質(zhì)條帶，說(shuō)明在這個(gè)分子質(zhì)量區(qū)間的蛋白質(zhì)數(shù)量較少。

2.3 微生物宏蛋白質(zhì)組LC-MS/MS鑒定結(jié)果

利用LC-MS/MS對(duì)豆醬中微生物宏蛋白質(zhì)組進(jìn)行檢測(cè)，搜索細(xì)菌和真菌數(shù)據(jù)庫(kù)，其中蛋白質(zhì)評(píng)分在38 分以上為可信（P＜0.05）。在豆醬微生物宏蛋白質(zhì)組中，共鑒定出232 種蛋白質(zhì)，其中包括173 種細(xì)菌蛋白質(zhì)，59 種真菌蛋白質(zhì)，見(jiàn)表1、2。

綜合分析，在232 種蛋白質(zhì)中，與糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)60 種，占25.9%，與核酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)57 種，占24.6%，與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)48 種，占20.7%，與能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)15 種，占6.5%，與脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)3 種，占1.3%，其他功能蛋白質(zhì)49 種，占21.1%。

微生物通過(guò)糖代謝為機(jī)體供能，并繼續(xù)進(jìn)行糖類的合成和分解。在微生物宏蛋白質(zhì)組中，檢測(cè)到與糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)量最多。而核酸與微生物生長(zhǎng)密切相關(guān)，其數(shù)量次之。蛋白質(zhì)的表達(dá)要經(jīng)過(guò)起始、延伸和終止3 個(gè)步驟，每一步都需要各種蛋白質(zhì)發(fā)揮作用[24]，其中，與谷氨酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，可能與其風(fēng)味相關(guān)。

2.4 基于宏蛋白質(zhì)組微生物來(lái)源分析

宏蛋白質(zhì)組來(lái)源于72 種細(xì)菌，23 種真菌。其中來(lái)自枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)有14 種，占6.0%，來(lái)自明串珠菌的蛋白質(zhì)有13 種，占5.6%，來(lái)自糞腸球菌的蛋白質(zhì)有11 種，占4.7%，來(lái)自腸膜明串珠菌和德氏保加利亞乳桿菌的蛋白質(zhì)有7 種，各占3.0%，來(lái)自鮑曼不動(dòng)桿菌、腸桿菌和大腸桿菌的蛋白質(zhì)有5 種，各占2.2%，來(lái)自大腸桿菌O157:H7、惡臭假單胞菌、化膿性鏈球菌血清型M3、解淀粉芽孢桿菌、乳酸乳球菌、嗜鹽四聯(lián)球菌、植物乳桿菌的蛋白質(zhì)有3 種，各占1.3%，來(lái)自其他細(xì)菌的蛋白質(zhì)有85 種，占36.6%；來(lái)自釀酒酵母的蛋白質(zhì)有17 種，占7.3%，來(lái)自裂殖酵母的蛋白質(zhì)有8 種，占3.4%，來(lái)自鏈孢霉的蛋白質(zhì)有4 種，占1.7%，來(lái)自白腐菌和棉阿舒囊霉的蛋白質(zhì)有3種，各占1.3%，來(lái)自其他真菌的蛋白質(zhì)24 種，占10.3%。

豆醬微生物宏蛋白質(zhì)組中，來(lái)源于細(xì)菌的蛋白質(zhì)數(shù)量幾乎為來(lái)源于真菌蛋白質(zhì)數(shù)量的3 倍，其中細(xì)菌來(lái)源以枯草芽孢桿菌、明串珠菌、糞腸球菌、腸膜明串珠菌和德氏保加利亞乳桿菌為主，真菌來(lái)源以釀酒酵母、裂殖酵母、鏈孢霉、白腐菌和棉阿舒囊霉為主。

目前已報(bào)道的豆醬中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相關(guān)研究，包括明串珠菌、芽孢桿菌和腸桿菌等[25-28]。芽孢桿菌可協(xié)助真菌分解大豆中的蛋白質(zhì)和淀粉，而明串珠菌則與豆醬中風(fēng)味物質(zhì)的形成相關(guān)。尤其是明串珠菌在其中占有優(yōu)勢(shì)，與本團(tuán)隊(duì)利用宏基因組技術(shù)進(jìn)行的分析，結(jié)果一致。之前的研究都還未明確確定明串珠菌在豆醬發(fā)酵過(guò)程中的重要地位，因此，本團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。此外，棉阿舒囊霉為豆醬中新發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌種。

除此之外，白色念珠菌、馬鏈球菌、惡臭假單胞菌為條件致病菌，金黃色葡萄球菌為病原菌，希瓦氏菌為腐敗菌，創(chuàng)傷弧菌可造成感染，蠟狀芽孢桿菌、威氏李斯特菌血清型6b可引起食物中毒，恥垢分枝桿菌可引起皮膚和軟組織感染，這些菌種可能來(lái)自于環(huán)境，也可能是發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的，它們對(duì)食用豆醬的安全性造成了威脅，因此對(duì)有害菌種的監(jiān)控還需加強(qiáng)。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)豆醬中微生物組成和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行了分析。其中，來(lái)源于細(xì)菌的蛋白質(zhì)數(shù)量幾乎為來(lái)源于真菌蛋白質(zhì)數(shù)量的3 倍，說(shuō)明了發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌逐漸取代真菌，占主導(dǎo)地位，而且明串珠菌可能在豆醬發(fā)酵過(guò)程中起到重要作用。從蛋白質(zhì)功能角度，以糖代謝、核酸代謝和蛋白質(zhì)代謝為主，其中的功能酶及與豆醬風(fēng)味相關(guān)的酶類需要進(jìn)一步研究。

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Metaproteomic Analysis of Traditional Fermented Soybean Paste in Northeast China

WU Rina1,2, XUE Yating1, ZHANG Ping1, TANG Xiaoyang1, TAO Dongbing1, YUE Yuanyuan1, ZHANG Pengfei1, CHEN Wei2,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to under the function of the microbial community in fermented soybean paste, we established a metaproteomic expression profile by stepwise extraction and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The proteins extracted were identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry-mass spectrometry (LC-MS/MS). Results obtained were as follows: the number of proteins identified in fermented soybean paste was 232, including 60 proteins participating in sugar metabolism, 57 proteins involved in nucleic acid metabolism, 48 proteins involved in metabolism, 15 proteins related to energy metabolism, 3 proteins related to lipid metabolism and 49 other functional proteins. The number of proteins derived from bacteria was almost three times as large as the number of proteins derived from fungi. Bacterial proteins were mainly derived from Bacillus subtilis, Leuconostoc, Fecal streptococcus, Leuconostoc mesenteroides and Deshi Lactobacillus, while fungal proteins mainly came from Saccharomyces cerevisiae, Fission yeast, Alternaria, white rot fungi and Ashbya gossypii.

fermented soybean paste; metaproteomics; protein function; microbiota

10.7506/spkx1002-6630-201714003

TS201.3

A

1002-6630（2017）14-0017-07

烏日娜, 薛亞婷, 張平, 等. 豆醬微生物宏蛋白質(zhì)組提取及分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 17-23.

10.7506/ spkx1002-6630-201714003. http://www.spkx.net.cn WU Rina, XUE Yating, ZHANG Ping, et al. Metaproteomic analysis of traditional fermented soybean paste in northeast China[J]. Food Science, 2017, 38(14): 17-23. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714003. http://www.spkx.net.cn

2016-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471713）；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2014M560395）；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2014048）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LR2015059）；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（1402071C）

烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wrn6956@163.com

*通信作者：陳衛(wèi)（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：chenwei66@jiangnan.edu.cn