食管鱗癌中骨橋蛋白、表皮生長因子受體與蛋白激酶B蛋白的表達及臨床意義

張 卉 楊德生 馬許輝 索智敏

(河南大學淮河醫院消化內科，河南 開封 475000)

食管鱗癌中骨橋蛋白、表皮生長因子受體與蛋白激酶B蛋白的表達及臨床意義

張 卉 楊德生 馬許輝 索智敏

(河南大學淮河醫院消化內科，河南 開封 475000)

目的 研究骨橋蛋白(OPN)及表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白激酶B(Akt)蛋白在食管鱗癌中的表達及與其臨床意義。方法 應用S-P免疫組化技術檢測70例食管鱗癌及其相應的癌旁正常組織中OPN和EGFR、Akt蛋白的表達。結果 70例食管鱗癌組織中OPN、EGFR、Akt蛋白的陽性表達率72.9%(51/70)、67.1%(47/70)、75.7%(53/70)均高于癌旁正常組織〔5.7%(4/70)、18.6%(13/70)、17.1%(12/70)，P<0.05〕；OPN的表達與淋巴結轉移、臨床分期相關(P<0.05)；EGFR蛋白的表達與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關(P<0.05)；Akt蛋白的表達與淋巴結轉移相關(P<0.05)。OPN與EGFR、Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達呈正相關(r=0.325、0.403，均P<0.05)，EGFR與Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達呈正相關(r=0.384，P<0.05)。結論 OPN可能通過激活EGFR /Akt所在的信號系統發揮其抗食管鱗癌作用。

骨橋蛋白；食管鱗狀細胞癌；表皮生長因子受體；蛋白激酶B

食管癌在我國腫瘤性死因中占第四位，其中絕大多數為鱗狀細胞癌，其發病機制涉及多基因的改變以及多條信號通路異常等〔1〕。骨橋蛋白(OPN)是從最初骨基質中發現的，具有多種功能的一種胞外基質蛋白，參與細胞黏附和細胞遷移，影響腫瘤發生和轉移進程。表皮生長因子受體(EGFR)為酪氨酸激酶受體，在體內通過多種信號途徑在腫瘤的發生發展中發揮重要作用〔2〕。PI3K/蛋白激酶B(Akt)信號途徑是癌細胞存活的首要通路，Akt位于其樞紐部位，位于EGFR下游，是EGFR信號傳導的一條主要通路〔3〕。本文應用免疫組化法檢測OPN和EGFR、Akt蛋白在食管鱗癌的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 河南大學淮河醫院胸外科2006年1月至2011年12月手術切除食管癌標本70例，均經HE切片病理證實為鱗狀細胞癌，所有病例術前均未接受任何放療或化療，并排除其他臟器的惡性腫瘤。選取同一病例的癌旁切緣正常組織70例作為對照。70例食管鱗癌中，男39例，女31例；年齡31～74〔平均(46.2±5.6)〕歲；高、中、低分化鱗癌分別為23例、34例和13例；淋巴結轉移37例，無轉移33例；按TNM分期標準，Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期16例及Ⅳ期17例；按浸潤深度分，T1 21例，T2 15例，T3 22例，T4 12例。

1.2 試劑 濃縮型鼠抗人單克隆抗體OPN、EGFR、Akt及免疫組化、DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化S-P法。取厚4 μm石蠟切片，常規脫蠟、水化后，采用電爐加熱煮沸修復抗原；OPN與EGFR、Akt蛋白單克隆抗體均按1∶100稀釋，操作參照產品說明書，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。用已證實的OPN、EGFR、Akt染色陽性食管鱗癌切片作陽性對照。

1.4 免疫組化結果判定 OPN與EGFR、Akt蛋白均按照以下標準：①根據染色程度及陽性細胞數來計算評分，a 染色程度：陰性(0分)，弱陽性(1分)，中等陽性(2分)，強陽性(3分)；b 陽性細胞數：無陽性細胞(0分)，陽性細胞1%～25%(1分)，陽性細胞26%～50%(2分)，陽性細胞>50%(3分)；a+b之和為3～6分者評為免疫組織染色陽性；計數方法，結果判定在雙盲法下進行，每張切片由兩名病理醫師分別判斷。兩者不一致時重新計數。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行χ2檢驗，Spearman相關分析。

2 結 果

2.1 OPN、EGFR、Akt蛋白的表達情況 70例食管鱗癌組織中，OPN陽性表達率72.9%(51/70)，其陽性表達部位為細胞質；EGFR的陽性表達率67.1%(47/70)，陽性表達部位為細胞膜；Akt的陽性表達率75.7%(53/70)，陽性表達部位為主要在細胞質，部分在細胞核，均呈強陽性過度表達現象。癌旁正常組織中，OPN、EGFR、Akt蛋白均為弱陽性低表達，陽性表達率分別為5.7%(4/70)、18.6%(13/70)、17.1%(12/70)。兩組間表達差異有統計學意義(χ2=51.148、33.717、36.664，P<0.05)。

2.2 OPN與EGFR、Akt蛋白的陽性表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系 OPN的陽性表達與淋巴結轉移程度、臨床分期相關(P<0.05)，與腫瘤分化程度及浸潤深度無關(P>0.05)；EGFR蛋白的陽性表達與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關(P<0.05)，與腫瘤分化程度無關(P>0.05)；Akt蛋白的陽性表達與淋巴結轉移相關(P<0.05)，與浸潤深度、腫瘤分化程度、臨床分期無關(P>0.05)。見表1。

表1 OPN、EGFR、Akt蛋白的陽性表達與食管鱗癌病理特征的關系〔n(%)〕

2.3 OPN與EGFR、Akt 蛋白在食管鱗癌中表達的相關性 OPN與EGFR、Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達呈正相關(r=0.325，P=0.006；r=0.403，P=0.001)，EGFR與Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達呈正相關(r=0.384，P=0.001)。

3 討 論

整合素是一類異源二聚體跨膜蛋白，作為受體，通過特異的Arg-Gly-Asp序列(RGD)識別包括纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白、骨橋蛋白等在內的細胞外基質蛋白。他們作為細胞功能的重要調節器，通過他們的調解黏附到細胞外基質，誘導細胞骨架重排，并激活細胞內的信號轉導通路的能力。整合素和生長因子受體調節相同的信號轉導通路，和他們一起調節細胞分化、增殖和存活〔4〕。OPN是與整合素結合的糖蛋白，參與各種生理和病理過程，包括炎癥，局部缺血-再灌注，骨吸收，動脈硬化和腫瘤進展等。OPN表面受體結合，引起在細胞功能的廣泛變化，如增強的移動性和黏附，加速生長和分裂，以及延長細胞的存活，從而腫瘤進展和轉移的過程中發揮重要作用〔5〕。Kita等〔6〕用免疫組化方法檢測175例食管癌中OPN的表達，發現OPN的表達與淋巴結轉移、淋巴管浸潤、淋巴結轉移、臨床分期顯著相關。在本研究中OPN表達于細胞質，在食管鱗癌中的陽性率顯著高于癌旁正常組織，且其表達與腫瘤的淋巴轉移、臨床分期相關，這與之前的報道相符。

EGFR是一種跨膜蛋白，屬于ErbB家族受體酪氨酸激酶(RTK)。它被激活后與EGF家族的肽生長因子結合，其中包括表皮生長因子(EGF)，轉化生長因子(TGF)-α等，通過與配體結合誘導ErbB受體聚合物和異二聚體，導致細胞質的激酶結構域的酪氨酸激酶自身磷酸化和激活。激活EGFR結果同時激活多個下游信號轉導通路調制的多效性細胞的反應，包括細胞增殖，遷移，侵襲，抑制細胞凋亡。除了配體誘導的信號途徑，可以由其他的蛋白激酶，如G-蛋白耦聯受體，細胞因子受體和黏附受體式(主要是整合素)激活〔7〕。整合素和生長因子受體之間的相互作用已被確認為腫瘤進展的很多方面至關重要。此外，這種配體-EGFR獨立激活EGFR的方式被認為在單克隆抗體抗EGFR治療發揮重要作用〔8〕。本研究顯示，EGFR在食管鱗癌組織中表達率顯著高于較正常組織，且與食管鱗癌的分化不良、腫瘤分期、淋巴轉移、浸潤深度、預后不良相關。與上述文獻報道相符。

Akt活化啟動由易位到質膜和磷酸化在Thr308位點由PI3K-依賴性蛋白激酶(PDK)1和Ser473的PDK2〔9〕。Akt的易位到不同的亞細胞，磷酸化它的底物，并調節不同的細胞功能，如存活，細胞周期進程和生長。研究表明，Akt蛋白在腫瘤發生發展過程通過多種信號通路被激活〔9，10〕。Akt的活化在腫瘤和其與臨床病理特征的相關性已被研究證實〔10〕。Takahashia等〔11〕從23例沒有術前化療的手術切除食管癌組織標本Akt1-3基因和蛋白表達進行了分析。通過免疫組化方法檢測，Akt主要表達于細胞質中，其陽性率為77.8%。這些與本實驗相符。本實驗中，Akt的表達與淋巴結轉移相關，提示Akt參與食管鱗癌的細胞增殖和浸潤轉移過程。

研究發現，OPN和EGFR基因表達上調，增加的NF-κB的活化與很強的相關性〔12〕。由EGF通過與受體結合可以在乳腺癌細胞，大鼠腎上皮細胞〔13〕，HepG2細胞〔14〕和HL60細胞〔15〕中誘導OPN基因的表達。在另一方面，在對乳腺癌細胞的體外研究表明，腫瘤細胞中的下游信號轉導途徑的激活導致了與整合結合的OPN誘發的c-Src的依賴性的EGFR的轉錄〔16〕。EGFR酪氨酸激酶信號途徑可被內在受體終止。整合素和生長因子受體各種激活和抑制信號的平衡被認為可以確定細胞的命運。然而，整合素和生長因子受體之間的相互作用比簡單的獨立激活相同的信號通路更復雜。在缺乏配體如EGFR的情況，整合素所誘導多種受體酪氨酸激酶激活都將被中斷。在細胞的生長和延長細胞的存活，蛋白質水解等生物學效應方面，骨橋蛋白和表皮生長因子受體配體結合和Akt的活化的信號途徑是重疊的〔17〕。

Akt是EGFR下游主要通路之一，是EGFR激活的關鍵〔18〕。EGFR的激活導致其磷酸化的Akt的活化絲氨酸-473。由于EGFR和Akt所涉及的各個方面，從腫瘤的發生，血管生成和轉移腫瘤的生長，EGFR-Akt軸線的是一個有吸引力的干預治療目標〔18〕。本實驗中發現EGFR和Akt蛋白在食管鱗癌中的表達呈正相關，與既往研究理論相符。Wang等〔19〕研究顯示，膠質瘤細胞分泌OPN通過的avβ3/PI3-K/Akt的信號轉導通路加速內皮細胞血管生成，包括增殖，遷移和管狀結構形成，提示OPN通過Akt所在的信號傳導途徑發揮其在腫瘤發生發展中的作用。在血管生成，轉移和抗凋亡等方面，EGFR，Akt也起著非常重要的作用。本實驗中，OPN與Akt蛋白在食管鱗癌中的高表達呈正相關，證實了上述觀點。

本研究發現，OPN可能通過激活EGFR/PI3K/Akt信號系統發揮其在腫瘤發生發展中的重要作用。

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〔2015-12-02修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

索智敏(1969-)，女，教授，碩士生導師，主要從事消化道腫瘤臨床研究。

張 卉(1980-)，女，碩士，主治醫師，主要從事消化道腫瘤臨床研究。

R735.1

A

1005-9202(2017)06-1432-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.056