葛根素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響及作用機制

金若天 殷 濤

(赤峰學院附屬醫院普外二科，內蒙古 赤峰 024000)

葛根素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響及作用機制

金若天 殷 濤

(赤峰學院附屬醫院普外二科，內蒙古 赤峰 024000)

目的 探討葛根素(Pue)對大鼠肝臟缺血再灌注(IR)損傷的保護作用及其對細胞凋亡的影響及可能機制。方法 健康雄性SD大鼠72只，隨機分為假手術組、IR組、缺血預處理(IP)組和Pue預處理組(Pue組)，每組按再灌注(1、6、24 h)三個時間點分3個亞組。建立動物模型；測Bcl-2、Bax蛋白的表達情況及肝組織凋亡指數(AI)；透射電鏡下觀察大鼠肝細胞的變化。 結果 與假手術組相比，IR組、IP組、Pue組肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達以及AI均增加(P<0.05)；與IR組比較，IP組、Pue組肝組織Bax蛋白的表達及AI減少，而Bcl-2蛋白表達增加(P<0.05)；與IP組比較，Pue組肝組織Bax蛋白的表達及凋亡指數減少，而Bcl-2蛋白的表達增加(P<0.05)。通過透射電鏡下對肝細胞學觀察，可見假手術組肝細胞形態基本正常，IR組損傷最重，IP組及Pue組損傷較IR組輕，Pue組要更輕。結論 IP及Pue都可通過上調Bcl-2蛋白的表達，抑制Bax蛋白的表達，來減輕肝細胞凋亡，相比之下后者效果要更好。

肝；缺血再灌注損傷；葛根素；凋亡

肝臟缺血再灌注(IR)損傷常見于很多的手術過程中，如肝部分切除術、肝移植等，直接影響到疾病的預后,細胞凋亡可能在肝臟IR損傷中起到了十分重要的作用〔1〕。Bcl-2和Bax基因是一組能對細胞凋亡能產生抑制和促進作用的基因。葛根素(Pue)能明顯改善大鼠腎臟,小腸等器官的IR損傷,可能是通過預防生物膜的脂質過氧化,減輕鈣超載，抑制凋亡等機制起到保護作用〔2,3〕,但其能否通過抑制肝細胞凋亡來減輕肝IR后的肝細胞損傷尚有待于進一步研究。本實驗探討Pue對肝臟IR損傷時細胞凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 72只健康雄性SD大鼠,由赤峰學院實驗動物中心提供，體重210～240 g。Pue(2 ml:100 mg) 為石家莊神威藥業有限公司生產,產品批號:20100175。免疫組化試劑盒Bcl-2、Bax購自北京博奧森生物技術有限公司。原位細胞凋亡檢測試劑盒購自德國羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 建立實驗動物模型 各組大鼠常規飼養。按規定要求術前禁食水。術前采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉、備皮、常規消毒皮膚。參照Pringle法〔4〕，建立肝IR損傷模型，取腹正中切口，分離并顯露肝門部，剪開左中肝葉各韌帶，游離左、中肝葉的膽管及門靜脈、肝動脈分支，用無損傷血管夾夾閉供應肝左外葉、肝中葉之門靜脈及肝動脈分支，造成70%肝缺血模型(阻斷后可見被阻斷區肝葉顏色由鮮紅色變為暗紅色表明肝臟缺血成功)，40 min后移走動脈夾恢復肝臟血流。

1.2.2 動物分組及實驗處理 72只大鼠隨機分為假手術組、IR組、缺血預處理(IP)組和Pue組，按再灌注1、6、24 h三個時間點分為3個亞組。IR組：缺血前5 min分別自尾靜脈緩慢注射0.9%氯化鈉2 ml；假手術組：同IR組，但只是暴露肝中葉和左葉的肝蒂，不阻斷血流；IP組：在實驗前阻斷肝門使其缺血5 min，然后開放5 min，反復3次；Pue組：按4 g/kg用0.9氯化鈉稀釋到2.0 ml，再灌注前5 min自尾靜脈注入。

1.2.3 標本收集 各組分別在再灌注1、6、24 h對6只大鼠取左肝固定部位的組織，大小適中，迅速放于-80℃冰箱中保存；每組上述3個時間點各取1只大鼠的左肝固定部分組織，一塊快速置于10%中性甲醛中固定；另一塊置于3%戊二醛中固定。

1.3 實驗指標檢測

1.3.1 Bcl-2、Bax免疫組化檢測及凋亡檢測 Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒SP法染色步驟進行。Bcl-2、Bax的陽性表達的依據是細胞質內呈現棕黃色染色。凋亡細胞檢測：按照試劑盒說明書進行操作，應用赤峰學院附屬醫院病理科圖像分析系統進行圖像處理，計算凋亡指數(AI)。

1.3.2 電鏡檢查 取出固定的肝組織塊，按照脫水，浸透，包埋，切超薄，染色，電鏡觀察，拍片等步驟進行。

1.4 統計學方法 應用SPSS14.0統計軟件進行SNK法比較。

2 結 果

2.1 各組Bax，Bcl-2表達及AI變化 與假手術組相比，IR、IP、Pue組肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達、AI均增加(P<0.05)；與IR組比較，IP、Pue組肝組織Bax蛋白表達及AI減少，而Bcl-2蛋白的表達增加(P<0.05)；與IP組比較，Pue組肝組織Bax蛋白表達及AI減少，而Bcl-2蛋白表達增加(P<0.05)。見表1～表3，圖1。

組別1h6h24h假手術組20.98±2.0820.93±2.0721.07±2.12IR組17.03±1.911)30.33±3.491)36.50±3.451)IP組26.33±2.451)2)41.17±3.911)2)30.50±2.941)2)Pue組31.84±2.781)2)3)50.00±4.011)2)3)58.00±4.661)2)3)

與假手術組比較：1)P<0.05；與IR組比較：2)P<0.05；與IP組比較：3)P<0.05，下表同

2.2 透射電鏡下觀察肝細胞超微結構變化 IR 6 h后，假手術組線粒體排列規則，細胞核核膜雙重結構清楚，內質網無擴張，排列規整；IR組線粒體明顯腫脹擴張，嵴斷裂，部分細胞核核膜消失，部分內質網擴張，其上的核蛋白體脫落；IP組部分線粒體輕微腫脹，無明顯擴張或空泡變性，核膜結構較清晰，內質網無明顯擴張，排列較規則；Pue組僅有少量線粒體略微腫脹，內質網稍有擴張，核膜結構很清楚，排列很規則。見圖2。

組別1h6h24h假手術組2.20±0.212.23±0.262.27±0.34IR組12.43±1.111)13.33±1.491)13.50±1.591)IP組10.33±1.051)2)11.17±1.711)2)11.50±1.841)2)Pue組7.84±0.881)2)3)8.00±0.911)2)3)8.10±1.061)2)3)

組別1h6h24h假手術組3.2±0.93.5±1.23.7±1.3IR組28.4±3.11)47.3±3.41)37.5±3.21)IP組25.3±2.51)2)35.7±3.71)2)31.50±3.41)2)Pue組17.4±2.81)2)3)28.0±3.51)2)3)22.1±3.01)2)3)

圖1 各組大鼠IR 6 h肝細胞凋亡情況(TUNEL，×400)

圖2 各組大鼠IR 6 h肝臟超微結構變化(×12 000)

3 討 論

肝IR損傷不僅是一個全身炎癥反應的過程，又是一個細胞凋亡的過程〔5〕。在IR時由于鈣超載、氧自由基、炎癥因子等因素共同存在時，改變了肝細胞的線粒體膜通透性，使得能量合成受到很大影響，進而發生細胞凋亡。Bcl-2作為Bcl-2家族蛋白中重要的抗凋亡基因，在IR中起非常重要的作用〔6〕，而Bax作為Bcl-2的同源體，其作用是抑制Bcl-2作用，促進細胞凋亡，兩者表達水平的平衡決定了凋亡信號刺激后細胞的存活或凋亡〔7〕。Bcl-2是一種原癌基因，其表達產物定位于線粒體，內質網及核膜上。作為重要的抑制凋亡基因，可通過其表達產物Bcl-2蛋白調節線粒體膜上通透性轉換孔，從而調節線粒體膜通透性〔8〕。此外，Bcl-2蛋白還可以利用抑制鈣離子釋放，來阻止促凋亡基因信號傳遞等發揮抗細胞凋亡的作用。Bax基因作為Bcl-2的同源基因，含有和Bcl-2基因一致的同源區域，其表達產物定位與Bcl-2蛋白相同，但其作用與Bcl-2蛋白結合形成結合體，兩者的比例關系則可以決定細胞的凋亡狀態〔9〕。當Bax蛋白表達高于Bcl-2蛋白時，形成Bax-Bax同源二聚體，使細胞凋亡增加；當Bcl-2蛋白表達高于Bax蛋白時，Bcl-2-Bcl-2形成同源二聚體，凋亡受抑制；而當Bcl-2蛋白與Bax蛋白表達水平相當時，Bcl-2與Bax形成異源二聚體，則細胞凋亡終止。本研究表明，在肝IR早期，IP通過誘導Bcl-2蛋白表達增加，進而改變Bax及Bcl-2蛋白的比例，形成更多的Bcl-2-Bcl-2同源二聚體，來抑制肝細胞凋亡。由此推斷，Pue素很可能通過上述途徑來抑制肝細胞的凋亡，且效果要比IP要好。另外，通過對IR后肝細胞的微觀結構觀察，也證實在IR 6 h后肝細胞的形態結構有很大程度的改變，Pue及IP組較IR組損傷較輕，而Pue組更輕。這也表明在IR早期，IP及Pue都對肝細胞有很大的保護作用，這種微觀變化可能是通過抑制肝細胞凋亡所起的作用。Pue所表現的效果顯得要更好。

1 Gujral JS,Bucci TJ,Farhood A,etal.Mechanism of cell death during warm hepatic ischemia-reperfusion in rats:apoptosis or necrosis〔J〕.Hepatology,2001;33(2):397-405.

2 邵亞芳,徐 群,沈艷艷,等.葛根素對肝缺血再灌注損傷所致心功能障礙的保護作用及機制〔J〕.中國現代普通外科進展,2011;14(4):20-2.

3 柳家賢,陳金和.葛根素對腸缺血再灌注大鼠腸粘膜細胞凋亡的影響〔J〕.中國藥理與臨床,2009;25(2):50-1.

4 Pringle JH.Notes on the arrest of hepatic hemorrhage Puee due to trauma〔J〕.Ann Surg,1908;48(4):541-9.

5 Selzner M,Rudiger HA,Selzner N,etal.Transgenic mice overexpressing human Bcl-2 are resistant to hepatic ischemia and reperfusion〔J〕.J Hepatol,2002;36(2):218-25.

6 孫 凱,劉志蘇,孫 權.大鼠肝臟缺血再灌注時肝細胞凋亡與Bcl-2蛋白表達的關系〔J〕.肝臟,2003；8(3):12-5.

7 Oltval Z,Milliman C,Korsmeyer S.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,bax,that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell,1993;74(4):609-19.

8 Marchetti P,Castedo M,Susin SA,etal.Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis〔J〕.J Exp Med,1996;184(3):1155-60.

9 夏先明,蘇 松,馮春紅,等.缺血預處理對肝缺血再灌注時細胞凋亡及調控基因表達的影響〔J〕.中國現代醫學雜志,2007;17(6):665-8.

〔2015-06-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

殷 濤(1984-)，男，主治醫師，碩士，主要從事中藥治療腹部疾病研究。

金若天(1980-)，男，副教授，主要從事中藥治療肝臟疾病研究。

R285

A

1005-9202(2017)06-1344-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.017