升降散治療血管性癡呆模型大鼠的療效及作用機制

史江峰 馬 健 郭春暉

(南京中醫藥大學基礎醫學院，江蘇 南京 210023)

升降散治療血管性癡呆模型大鼠的療效及作用機制

史江峰1馬 健 郭春暉1

(南京中醫藥大學基礎醫學院，江蘇 南京 210023)

目的 探討升降散治療血管性癡呆模型大鼠的臨床效果及作用機制。方法 SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和升降散組，假手術組大鼠僅切開頸前，模型組和升降散組大鼠行2-AO法永久性結扎雙側頸總動脈得到血管性癡呆模型大鼠。應用Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力，免疫熒光組織化學染色檢測血管內皮生長因子(VEGF)陽性細胞數和計數微血管密度(MVD)，細胞凋亡檢測采用TUNEL法，采用SABC免疫組織化學法檢測Bcl-2，Bax蛋白陽性表達。結果 給藥后，升降散組和模型組大鼠的學習次數高于假手術組、正常組，正確次數均顯著低于假手術組、正常組(P<0.05)，升降散組大鼠學習次數低于模型組，正確次數顯著高于模型組(P<0.01)；正常組和假手術組大鼠僅有少量VEGF陽性細胞，升降散組陽性細胞數量最高，顯著高于其他三組(P<0.01)；升降散組海馬CA1區凋亡細胞數顯著低于模型組而顯著高于正常組和假手術組(P<0.01)；海馬CA1區Bcl-2和Bax 陽性細胞數模型組大鼠高于正常組和假手術組(P<0.01)，升降散組大鼠海馬CA1區Bax 陽性細胞數明顯低于模型組而Bcl-2陽性細胞數明顯高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論 升降散可促進腦部血管再生，可通過下調Bax 蛋白和上調Bcl-2 蛋白表達以抑制腦細胞的凋亡，顯著改善癡呆大鼠的學習、記憶能力。

升降散；血管性癡呆

血管性癡呆(VD)屬于臨床常見的疾病，指的是腦血管疾病造成的嚴重認知功能障礙的一組臨床綜合征，伴隨著我國人口老齡化加劇，VD的發病率逐年上升，為僅次于阿爾茨海默病的老年性癡呆疾病，嚴重影響患者生活質量，目前缺乏理想的治療藥物〔1〕。本病主要是由于腦血管病變引發腦部缺氧、缺血造成記憶及認知等特定功能的神經組織功能障礙，由于缺血后再灌注極易致海馬神經造成損傷并出現神經元死亡，進而誘發永久性腦損傷。中醫理論認為，老年臟腑虛衰，腎精虧虛，腦髓不充，痰癖阻絡，靈機不聰是癡呆的主要病因病機，但是中藥在作用機制方面還有待進一步研究〔2〕。本研究探討升降散治療VD模型大鼠的效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取出生1 w的雄性健康SD大鼠72只，體重240～260 g，在有光環境和黑暗環境每12 h交替喂養，自由進食和飲水。

1.2 實驗藥物及儀器 藥物為本院自制膠囊制劑升降散，由僵蠶、蟬蛻、姜黃、川大黃組成，制作成膠囊每粒重0.4 g。Morris 水迷宮由淮北正華生物儀器設備有限公司提供；Bcl-2，Bax 免疫組織化學試劑盒為武漢博士德生物工程公司生產，兔Ⅷ因子多克隆抗體購于北京中生公司；小鼠血管內皮生長因子(VFGF)單克隆抗體購于南京建成生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 造模和分組 全部SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和升降散組，每組均18只。模型組和升降散組大鼠適應性喂養7 d，術前12 h禁食、不禁水，麻醉使用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，將大鼠固定于鼠板上并碘酒消毒；以大鼠頸部中央處為切口點，雙側頸總動脈鈍性分離，腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg后立即夾閉10 min雙側頸總動脈，逐層縫合傷口后放回籠中繼續飼養。假手術組大鼠行頸前切開而不阻斷雙側頸總動脈、不注射硝普鈉。大鼠喂養環境為 20℃左右，術后肌注青霉素2 000 U/d，連續 3 d。造模3 d，大鼠活動減少、行為遲緩、飲食下降代表建模成功，各組大鼠均隨機選取12只作為研究。

1.3.2 給藥方法 升降散組給予大鼠用生理鹽水溶解的升降散，按10 ml/kg給藥靜脈滴注；其余三組均給予生理鹽水10 ml/kg靜脈滴注。

1.4 學習記憶能力測試 包括定位航行測試和空間搜索測試，前者為給藥30 d后，水迷宮共分4個象限，大鼠朝池壁放入水中，隨機選擇方位作為起始位置，記錄動物找到水下平臺時間，每只大鼠每天共訓練4次，每次需間隔0.5 h，聯系訓練5 d，第6天測定有效區停留時間、停留距離、逃避潛伏期及總路程等指標。定位航行能力測試后第2天開始空間搜索測試，平臺去除，探查測試持續120 s，動物經先前象限的對側入水，并記錄大鼠途經有效區及虛擬平臺的停留時間、距離、次數、有效停留時間距離和轉向角等檢測指標。

1.5 動物處死與標本收集 所有大鼠測試后稱重，用 10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術臺上，將各組動物快速斷頭處死。標本收集在冰盤上快速剖取腦組織，吸取血跡，稱量左側皮層腦組織100 mg左右，加預冷的生理鹽水制成10%的組織勻漿，4℃3 000 r/min，離心10 min，取上清液，儲存-20℃冰箱備用。

1.6 免疫熒光組織化學染色 顯微鏡下觀察VEGF陽性細胞數量，每只大鼠抽取隨機切片2張，觀察4個不重疊視野，計數4個視野下陽性細胞的總數，然后計算平均數。Ⅷ因子應用在微血管密度(MVD)計算方面，隨機取大鼠切片2張，選擇皮質區血管最豐富4處置于100倍鏡下觀察；微血管數量及計算每mm2內微血管量置于400倍鏡下觀察。

1.7 細胞凋亡和Bcl-2、Bax檢測 采用免疫組化SABC方法檢測，陽性標準：光鏡下(1)出現棕黃色顆粒Bcl-2蛋白；(2)棕黃色顆粒Bax蛋白可見于胞質及核膜內；高倍鏡下隨機觀察10個不重疊的胞質內皮質缺血區并計算出平均細胞陽性數。

1.8 統計學方法 應用SPSS16.0軟件行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠學習記憶功能檢測結果 給藥后，升降散組和模型組大鼠的學習次數高于假手術組、正常組，正確次數均低于假手術組、正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；而升降散組大鼠學習次數低于模型組、正確次數高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2 VEGF陽性細胞檢測結果 VEGF陽性細胞的胞膜或胞質為深棕黃色。見圖1。正常組〔(54.78±3.53)個〕和假手術組〔(59.58±3.35)個〕大鼠僅有少量VEGF陽性細胞，陽性細胞數升降散組〔(82.89±3.25)個〕顯著高于其他三組，模型組為〔(71.12±5.47)個〕(P<0.01)。

2.3 MVD檢測結果 400倍光鏡下觀察，染色微血管形態無規則性，血管含有和不含有單層內皮細胞構成管腔血管比例相當，內皮細胞排列成條狀或聚集成細胞團簇，或僅單個內皮細胞。見圖2。MVD模型組〔(21.78±2.76)個/mm2〕與其他三組〔正常組(16.78±1.58)個/mm2，假手術組(18.80±1.69)個/mm2，升降散組(31.68±2.87)個/mm2〕比較差異有統計學意義(P<0.01)。

組別學習次數正確次數正常組31.17±3.127.85±0.81假手術組32.98±3.257.55±0.78模型組54.47±5.064.80±0.79升降散組40.12±3.856.21±0.88F/P值12.358/0.004213.054/0.0032

圖1 各組VEGF陽性細胞(DAB，×400)

圖2 各組Ⅷ因子標記陽性血管(DAB，×400)

2.4 海馬CA1區細胞凋亡結果 給藥后，大鼠海馬CA1區凋亡細胞數升降散組為(18.28±4.43)個，顯著高于正常組〔(2.64±1.37)個〕和假手術組〔(3.81±1.85)個〕，差異有統計學意義(P<0.05)，而顯著低于模型組〔(28.89±5.58)個〕，差異有統計學意義(P<0.05)，(P<0.01)，見圖3。

2.5 海馬CA1區Bcl-2、Bax免疫組化結果 給藥后，大鼠海馬CA1區Bcl-2和Bax 陽性細胞數模型組均高于正常組和假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)，升降散組大鼠海馬CA1區Bax 陽性細胞表達數明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，而Bcl-2陽性細胞表達數明顯高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2，圖4。

圖3 凋亡細胞染色結果(×400)

組別Bcl-2陽性細胞數Bax陽性細胞正常組3.12±1.353.23±0.75假手術組3.64±1.473.55±0.77模型組14.25±2.3135.18±1.56升降散組25.20±2.2117.58±1.34F/P值20.422/<0.000132.054/<0.0001

圖4 Bcl-2、Bax免疫組化染色結果(DAB，×400)

3 討 論

VD屬于臨床常見的老年慢性疾病，影響發病的因素較多，持續性高血壓可損傷小動脈，增大血管阻力并減少血流量，造成心律失常而使血流量急劇降低，部分患者脂肪沉積在血管壁形成粥樣硬化斑塊也與VD發病相關。VD主要是由于腦血管病變引發腦組織缺氧、缺血而損傷腦部記憶、認知等特定神經組織所致〔3〕。患者出現腦缺血缺氧病理生理改變，缺氧狀態下大腦皮質、海馬、紋狀體、蒼白球等最容易受到損傷，腦缺血后使能量供應不足，細胞釋放大量谷氨酸，細胞外液谷氨酸水平急劇升高，過度激活相應受體而使鈣離子內流，誘發酶信號的級聯反應，合成大量自由基而損傷細胞質、脂肪酸，而細胞去極化釋放的鉀離子可引發梗死處去極化，此外自由基還可激活炎癥因子，加劇炎癥反應并合成自由基從而進入惡性循環〔4〕。

中醫學理論認為本病病位在腦和心，同肝脾肺腎臟腑功能失衡相關，腦為髓海，是元神之府，人至暮年，臟腑功能減退，肝腎虧虛，腎中精氣不足，不能生髓，髓海空虛，進而神機失用形成呆證；另一方面部分患者平素憂思多慮，積怒傷肝，肝失疏泄，肝氣郁滯，肝郁乘脾，脾失健運，痰濁內生，痰濁上擾蒙蔽清竅，思慮過度則耗上心脾，暗耗陰血，氣血生化乏源，氣血不足，不能充養腦髓，腦失所養，神機失用，造成神志失常，形成呆證，因此本病病位在心腦，病性屬于本虛標實，因此在治療上需要制定以調暢氣機、補充血脈為原則的治療方案〔5〕。

腦作為人體耗氧量最多的器官之一，其中不飽和脂肪酸含量豐富，一旦發生缺血缺氧就會產生大量的氧自由基，自由基化學性質活潑，能夠直接攻擊生物膜磷脂中不飽和脂肪酸，造成大腦神經細胞損傷繼而讓神經元丟失產生癡呆〔6〕。自由基介導的脂質過氧化反應在中樞神經病變中起到了重要作用，其引發損傷一直貫穿神經損傷進程，自由基最容易攻擊腦細胞膜中多不飽和酸雙鍵，還可以繼續損傷蛋白與核酸，引發細胞進一步凋亡與蛋白質和DNA破壞。VD同梗死面積和低灌注具有很好的相關性，梗死灶的數量與范圍是決定癡呆發生的重要因素。研究顯示人體腦缺血和缺氧后，通過旁分泌機制促進了酪氨酸激酶受體-4和特異性酪氨酸激酶受體-1表達過程，誘導體內VEGF，激活細胞信號及轉導機制，加快內皮細胞的增殖速率而形成新血管，并發揮加速神經干細胞增殖及保護神經元的作用，有效減少神經元缺損〔7〕。改善局部的微循環及促進血管再生對治療VD具有重要意義，VEGF則在正調節因子中較為重要，特異性促進血管內皮細胞生長，起到了再生血管形成的啟動效果〔8〕。

Ⅷ因子可以判斷血管密度，進而判定腦組織中新生血管數量，同樣可以體現對VD改善的效果。細胞凋亡是一個基因控制細胞死亡的過程，主要包括兩方面：Bax為主導的促細胞凋亡；Bcl-2基因為主導的抗細胞凋亡。調控細胞凋亡的過程由兩者表達水平決定，Bcl-2是內源性神經保護物質的一種，體內高Bcl-2可以阻滯多種凋亡因子，延長了細胞壽命，而過度Bax表達可通過形成同源二聚體而促進細胞凋亡〔9，10〕。

中藥升降散方中僵蠶性溫，歸心、脾、肺、肝經，發揮清熱解郁、祛風除濕、化痰散結的作用，藥性輕浮上升，屬于陽中之陽，引諸藥上行，直達病所，《本草綱目》中記載：“治風化痰，散結行經，所謂因其氣相感，而以意使之者也。蓋厥陰、陽明之藥，故又治諸血病、癥病、拒病也”〔11〕；蟬蛻甘咸，其氣清肅，升浮宣透，能夠清熱解毒宣毒透表；姜黃氣味辛苦性寒，可以行氣活血化瘀，暢通氣機，活血通絡，溫散寒邪，助僵蠶和蟬蛻散郁火；大黃作為使藥，苦寒泄瀉，通腑化瘀，清熱瀉火，擅長降濁陰，攻積導滯，推陳出新，讓體內血液通暢而氣行；全方合用寒溫并用，升降同施，具有升清降獨、通里達表、宣郁散火、活血化癖、驅風勝濕、鎮驚止痙的作用。

本研究顯示，升降散應用在VD模型大鼠中能夠改善學習記憶功能。升降散可能是通過促進缺血區血管生成、改善局部血液循環發揮作用。升降散可能通過下調Bax蛋白和上調Bcl-2蛋白的表達減少細胞凋亡，并對VD大鼠認知功能起到改善作用。

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〔2016-04-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

馬 健(1959-)，男，博士，博士生導師，主要從事中醫腦病基礎及臨床研究。

史江峰(1971-)，男，碩士，主任中醫師，主要從事腦病中醫基礎及臨床研究。

R749

A

1005-9202(2017)06-1341-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.016

1 徐州市中醫院腦病科