異甘草酸鎂對H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、腫瘤壞死因子-α、血管內皮生長因子表達的影響

任炳楠 楊玉鵬 張煥玲 劉洪濤 田冬冬 吳 茵 魏 欣

(河北省人民醫院，河北 石家莊 050051)

異甘草酸鎂對H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、腫瘤壞死因子-α、血管內皮生長因子表達的影響

任炳楠 楊玉鵬 張煥玲1劉洪濤 田冬冬 吳 茵 魏 欣

(河北省人民醫院，河北 石家莊 050051)

目的 探討異甘草酸鎂(MGIG)對肝癌小鼠模型肝癌前病變的作用。方法 通過H22細胞皮下注射建立肝癌動物模型,在制模過程中給予MGIG 50 mg/kg和5-Fu 10 mg/kg進行干預,通過免疫組化法檢測肝組織中的核因子(NF)-κB p65、血管內皮生長因子(TNF)-α和血管內皮生長因子(VEGF)表達，同時檢測血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。結果 MGIG+5-Fu組的NF-κB p65、TNF-α和VEGF表達和血清ALT、AST水平均小于5-Fu組和陽性對照組,差異有統計學意義(P<0.05%)。結論 MGIG對小鼠肝癌病變有一定的抑制作用，這種作用可能與抑制腫瘤細胞炎癥因子有關。

肝癌;異甘草酸鎂;核因子κB p65；腫瘤壞死因子α；血管內皮生長因子；H22細胞

異甘草酸鎂(MGIG)是第4代甘草制劑，具有保護肝細胞膜、改善肝功能、延緩肝纖維化的作用，對急性肝損傷具有良好的防治作用〔1〕。研究表明甘草酸對肝纖維化過程中的炎性因子有抑制作用〔2〕，但其在肝癌中的作用尚需進一步證實。本研究應用H22細胞移植小鼠肝癌模型研究MGIG對小鼠肝組織中核因子(NF)-κB p65、腫瘤壞死因子(TNF)-α和血管內皮生長因子(VEGF)表達情況和血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)水平的影響，探討MGIG對肝癌細胞炎性因子的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性昆明小鼠,6周齡,體質量(25 ±5)g,清潔級,購自河北醫科大學實驗動物中心(動物合格證:1503010)。顆粒狀飼料購自河北醫科大學實驗動物中心。

1.2 藥品與儀器 MGIG購自江蘇正大天晴制藥有限公司；H22細胞來自河北醫科大學基礎醫學院分子生物學教研室，NF-κB p65、TNF-α和VEGF試劑盒和鹽酸二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑購自博士德公司。顯微鏡和COMS纖維成像系統為日本奧林巴斯產品(BX51T-PHD-J11)，數據采集使用美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus，全自動生化分析儀使用日本TOSHIBA公司TBA-40FR。

1.3 分組及給藥方法 53只昆明小鼠分為四組，其中隨機取8只作為空白對照組，其余45只參照文獻〔3〕用于建立肝癌小鼠模型，小鼠腹水型肝癌細胞株H22用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養液常規傳代培養。對數生長期細胞以質量分數0.9%的氯化鈉溶液調整細胞密度至1×106個/ml，取0.5 ml細胞懸液接種于小鼠腹腔中，7 d后抽取小鼠腹水，用0.9%氯化鈉稀釋成1∶4的細胞懸液，0.2 ml/只接種于45只小鼠右側腋窩皮下。24 h后將已經接種的小鼠隨機分為三組：對照組(0.9%氯化鈉注射液NS組)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)組和MGIG+5-Fu組，每組15只，各組間小鼠質量差異無統計學差異(P> 0.05)。各組小鼠腹腔灌注給藥(MGIG 50 mg/kg，5-Fu 10 mg/kg)，1次/d，連續給藥7 d，末次給藥24 h后摘取眼球取血，然后頸椎脫臼處死，解剖后觀察腫瘤生長情況。

1.4 肝組織處理 取出肝臟,在右前、右后肝葉最大直徑處各取2 塊,用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS,pH7.0 ～ 7.6,含0.1%DEPC)進行固定，24 h 之后進行石蠟包埋。

1.5 免疫組化指標和血清中生化指標的檢測 用免疫組化SP染色方法檢測肝組織中NF-κB p65和VEGF及TNF-α的表達情況。切片常規脫蠟入水，使用抗原修復液水浴修復，滴加山羊血清封閉液，室溫20 min。切片上滴加第一抗體，4℃過夜，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×5 min；切片上滴加第二抗體，37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃ 20 min，0.1 mmol/L PBS洗3次×5 min；DAB顯色，蘇木素復染，水洗，中性樹脂封片，DAB 顯色，顯微鏡下觀察。使用全自動生化分析儀測定血清ALT與AST的含量。

1.6 結果判定 末次給藥24 h 后，取腫瘤組織，稱質量，計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組瘤質量-實驗組瘤質量)/對照組瘤質量，均取平均值。免疫組化染色結果：NF-κB p65 陽性表達定位于肝細胞核和細胞質內，呈棕黃色顆粒。VEGF 染色呈棕黃色細顆粒表達于胞膜和胞質；TNF-α主要來自于單核細胞、吞噬細胞，染色呈黃色，表達于細胞膜或細胞質。參照文獻〔7〕中標準，每張切片隨機選擇5 個視野,每個視野計數80～100個細胞,根據染色的深度及陽性細胞的數量分別計分:不著色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。陽性細胞數<1%為0 分,1%～10%為1分,11%～50%為2分,51%～80%為3分,81%～100%為4分。

1.7 統計學方法 應用SPSS16.0軟件行獨立樣本的t檢驗。

2 結 果

2.1 一般情況及腫瘤組織大小 實驗過程中,各組均無小鼠死亡。實驗組小鼠腫瘤組織直徑增大。NS組的腫瘤組織質量〔(3.29±1.21)g〕最大，與5-Fu組〔(0.83±0.26)g〕和MGIG+5-Fu組〔(0.4±0.14)g〕相比差異有統計學意義(P<0.05)，5-Fu組與MGIG+5-Fu組的抑瘤率分別為56.53%、84.80%，提示MGIG與5-Fu對腫瘤增長有抑制作用。MGIG+5-Fu組腫瘤組織質量小于5-Fu組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化染色檢測結果 NF-κB p65、TNF-α和VEGF陽性細胞主要呈彌漫性分布，見圖1。各實驗組NF-κB p65表達和ALT、AST水平與空白對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。與NS組相比，5-Fu組和MGIG+5-Fu組的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表達和ALT、AST水平均明顯減少，差異有統計學差異。與5-Fu組相比，MGIG+5-Fu組的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表達和ALT、AST水平均明顯減少，差異有統計學意義。見表1。

圖1 各組積分光密度(DAB)

組別n積分光密度NF-κBp65VEGFTNF-αALT(U/L)AST(U/L)空白對照組815.85±2.214.00±1.117.38±2.33142.15±5.8833.00±2.85NS組1547.53±9.971)39.40±3.051)66.53±3.651)193.33±14.231)62.80±4.981)5-Fu組1522.33±3.861)2)16.00±1.031)2)12.67±1.251)2)169.67±4.741)2)61.73±4.451)MGIG+5-Fu組1519.33±3.861)2)3)12.93±2.261)2)3)10.93±1.611)2)3)140.80±3.432)3)33.06±2.172)3)

與空白對照組相比:1)P<0.05；與NS組相比:2)P<0.05；與5-Fu組相比:3)P<0.05

3 討 論

肝癌的發生與NF-κB的表達密切相關，NF-κB 在肝癌組織中表達較高，是炎癥致癌過程中主要的調節因子，活性增加可導致腫瘤體積增大，在炎癥的刺激下，NF-κB磷酸化而抑制作用消失，使活化的 NF-κB進入細胞核而激活一系列的炎癥因子〔7～10〕。在抗腫瘤的過程中抑制NF-κB 的活化可提高治療效果。p65是NF-κB的亞基，參與調控下游基因的轉錄，具有轉錄激活的作用，可調控VEGF和TNF-α的表達，且與VEGF和TNF-α的表達正相關〔8〕。TNF-α是一種細胞因子，具有調節免疫應答、促進細胞生長分化的功能，能夠活化巨噬細胞，增強淋巴細胞免疫功能，引起腫瘤血管損傷，抑制腫瘤血管形成。TNF-α體內濃度較低，適量對機體有保護作用，過量則對機體產生損傷反應〔9〕。TNF-α可通過激活NF-κB信號轉導，促進肝癌細胞上皮間質轉化，促進肝癌的侵襲轉移〔10〕。VEGF是一種腫瘤血管生長因子，主要通過促進血管內皮細胞增殖而促進腫瘤血管生成，表達水平與腫瘤惡性程度密切相關〔11〕。NF-κB 的激活可造成腫瘤組織對化療的抵抗而導致治療失敗，抑制NF-κB的激活可以提高化療的療效，延緩疾病進展和復發〔7〕。MGIG是甘草酸單一異構體鎂鹽，能夠顯著抑制炎癥因子TNF-α和NF-κB p65〔12〕。本結果表明，MGIG聯合5-Fu干預H22小鼠腫瘤，能夠明顯抑制腫瘤生長、抑制腫瘤相關因子表達和抗血管生成，同時降低肝臟細胞的損傷。MGIG聯合5-Fu能夠明顯降低小鼠腫瘤組織NF-κB p65、TNF-α和VEGF的表達，其機制可能與阻斷NF-κB 下游通路、抑制TNF-α和VEGF的表達從而抑制腫瘤細胞的生長、增殖有關。

1 湯麗娜，林 峰，沈 贊,等.異甘草酸鎂治療抗腫瘤藥物引起的急性藥物性肝損傷的Ⅲ期臨床試驗〔J〕.腫瘤,2012;32(9):738-43.

2 Tang B,Qiao H,Meng F,etal.Glycyrrhizin attenuates endotoxin-induced acute liver injury after partial hepatectomy in rats〔J〕.Braz J Med Biol Res,2007;40(12):1637-40.

3 姜 晗,任 軍,崔 勇,等.小鼠原位移植性肝癌模型的建立及其磁共振表現〔J〕.現代腫瘤醫學,2007;15(2):174-6.

4 姚登福,蘇小琴.肝細胞核因子-κB異常激活與肝細胞癌變〔J〕.中華肝臟病雜志,2006;14(7):539-40.

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8 梁杰聰,溫 哲,宋俏莉.核因子-κBp65對肝門靜脈海綿樣變性大鼠門靜脈及其周圍組織中血管內皮生長因子、腫瘤壞死因子-α、內皮素表達的影響〔J〕.中國醫藥導報,2015;12(27):18-21.

9 曹 巖，劉 陽，楊春榮,等.原發性肝癌患者血清中TNF-a、IL-6、IL-8 和sIL-2R 的測定及其臨床意義〔J〕.中國實驗診斷學，2008;12(1):101-4.

10 寇興瑞，井瑩瑩，喻國鋒,等.腫瘤壞死因子α通過核因子κB促進肝癌細胞上皮間質轉化〔J〕.第二軍醫大學學報,2013;34(3):271-6.

11 鄭安紅,張維東,王兆朋,等.蝎毒多肽增強 5-氟尿嘧啶對 H22 肝癌抑制作用的機制研究〔J〕.中草藥,2013;44(11):1465-9.

12 徐建國.異甘草酸鎂抗皮炎濕疹藥效學及其抗炎機制研究〔D〕.上海：第二軍醫大學,2010.

〔2016-03-18修回〕

(編輯 袁左鳴)

河北省衛生廳科研基金項目(No.20130410)

楊玉鵬(1983-),男,碩士，主治醫師,主要從事抗腫瘤藥物研究。

任炳楠(1983-),男,碩士,主要從事抗腫瘤藥物研究。

R73

A

1005-9202(2017)06-1330-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.011

1 河北醫科大學實驗動物學部 河北省實驗動物重點實驗室