葶藶生脈方中揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合工藝

王紅芳 張靜宜 侯芳潔 李春花

(河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200)

葶藶生脈方中揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合工藝

王紅芳 張靜宜1侯芳潔 李春花1

(河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200)

目的 以羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)為包合材料，制備葶藶生脈方中白術(shù)、桂枝的揮發(fā)油成分包合物,以改善其難溶性、不穩(wěn)定性和提高其生物利用度。方法 通過L9(34)正交設(shè)計試驗，分別采用攪拌法、研磨法制備HP-β-CD包合物，以包合物收得率、含油率、包合率為評價包合工藝的技術(shù)指標(biāo)，并利用紫外分光光度法和薄層色譜法對包合物進(jìn)行驗證，優(yōu)選最佳工藝。結(jié)果 包合最佳工藝為：揮發(fā)油與HP-β-CD比例為1∶10，2倍水量，研磨2 h達(dá)到最佳效果。結(jié)論 該工藝制備的揮發(fā)油包合物的包合率高，方法簡便、可行，為葶藶生脈方開發(fā)成現(xiàn)代中藥制劑奠定了重要基礎(chǔ)。

正交試驗；揮發(fā)油；羥丙基-β-環(huán)糊精；包合物；薄層色譜法；紫外分光光度法

葶藶生脈方由紅參、葶藶子、桂枝、白術(shù)等13味藥組成，是全國名老中醫(yī)邢月朋治療慢性充血性心力衰竭(CHF)的經(jīng)驗方。方中白術(shù)、桂枝主要有效成分是以萜類及其衍生物為主的揮發(fā)油，現(xiàn)代藥理研究已證實：桂枝中的揮發(fā)性成分具有中樞和外周性血管擴(kuò)張作用，并能增強(qiáng)血液循環(huán)〔1〕，改善心肌缺血和供氧等狀況〔2〕；白術(shù)揮發(fā)類成分有調(diào)節(jié)胃腸道蠕動、運脾利濕〔3〕、抑制心肌收縮等作用〔4〕，均為治療氣虛血瘀、陽虛水停型CHF的藥效成分。但由于此類成分具有揮發(fā)性且在氧、光、熱的作用下極易分解、變質(zhì)，因此，有不宜貯存且生物利用度低等缺點。目前，國內(nèi)文獻(xiàn)尚無使用新型輔料羥醛-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)對白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油進(jìn)行包合的報道。本研究將運用攪拌法和研磨法制備包合物，并采用正交試驗以包合物收得率、含油率、包合率為評價指標(biāo)，篩選出最佳工藝，旨在掩蓋不良?xì)馕丁⒃黾铀幬锶芙舛燃疤岣咚幬锏姆€(wěn)定性〔5〕，為該方開發(fā)為現(xiàn)代劑型提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料

TG328B型分析天平(上海精科天平儀器廠)；TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；UV-2450 紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)；85-2型恒溫磁力加熱攪拌器(常州智博瑞儀器制造有限公司)；KQ-100E型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

HP-β-CD(山東濱州化學(xué)試劑廠)；桂枝、白術(shù)購于石家莊樂仁堂，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔講師鑒定符合2010版藥典一部相關(guān)規(guī)定；無水硫酸鈉、無水乙醇、環(huán)己烷、乙酸乙酯、石油醚(60℃～90℃)等均為分析純(深圳市中發(fā)源生物科技有限公司)；雙蒸水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取 按處方比例分別取白術(shù)、桂枝適量，采用本課題組前期研究確定的最佳工藝，即10倍量的水，浸泡6 h，提取4 h，得黃色油狀液體，收集芳香水進(jìn)行二次蒸餾提取，合并兩次所得揮發(fā)油，離心(溫度15 ℃，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時間6 min)，無水硫酸鈉脫水，過濾即得純揮發(fā)油，備用。

2.2 揮發(fā)油空白回收率的測定〔6〕按《中國藥典》2010年版一部附錄XD項下“揮發(fā)油測定法”依法進(jìn)行測定〔7〕。將1 ml所提混合揮發(fā)油置于裝有沸石的圓底燒瓶中，加蒸餾水150 ml，蒸餾4 h，并按照“2.1”方法收集揮發(fā)油，準(zhǔn)確讀取揮發(fā)油的量。平行3次試驗，計算揮發(fā)油的空白回收率。空白回收率(%)=回收揮發(fā)油量(ml)/揮發(fā)油加入量(ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油的平均空白回收率為64.0%。

2.3 揮發(fā)油包合率、包合物產(chǎn)率及包合物含油率的測定〔8〕稱取制備好的揮發(fā)油包合物于圓底燒瓶中，加150 ml蒸餾水，混合均勻，按《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測定甲法提取揮發(fā)油，至油量不再增加時停止加熱，冷卻至室溫，按照“2.1”項下方法收集揮發(fā)油，準(zhǔn)確讀取揮發(fā)油量(ml)，計算揮發(fā)油包合率，根據(jù)真空干燥所得的包合物質(zhì)量計算包合物收得率及包合物的含油率，計算公式：包合物含油率= 包合物中揮發(fā)油質(zhì)量/包合物總重量×100%；包合物收得率= 包合物質(zhì)量/(HP-β-CD加入質(zhì)量+揮發(fā)油加入質(zhì)量)×100%；揮發(fā)油包合率=包合物中揮發(fā)油量/(揮發(fā)油投入量×空白回收率)×100%。

2.4 揮發(fā)油包合工藝的優(yōu)選

2.4.1 研磨法包合物的制備 通過查閱文獻(xiàn)〔9〕，影響HP-β-CD 包合揮發(fā)油工藝的主要因素有揮發(fā)油與HP-β-CD的投料比(A)、加水量(B) 及包合時間(C)。采用L9(34)正交表安排實驗，制備包合物；按照“2.3”方法計算各項指標(biāo)，其中包合率是評價包合效果的重要指標(biāo)，包合率越高，揮發(fā)油的包合效果越好，越有利于制劑的穩(wěn)定性，故權(quán)重系數(shù)定為0.6；收得率在實際生產(chǎn)中具有重要意義，在投入量一定的情況下，收得率越高，包合效果越好，權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.2；含油率在控制制劑質(zhì)量方面有重要意義，權(quán)重系數(shù)定為0.2〔10〕。計算公式為：綜合評分= (包合率/包合率max)×0.6 +(收得率/收得率max)×0.2+ (含油率/含油率max)×0.2(包合率max、收得率max和含油率max分別是試驗中各指標(biāo)的最大值)。因素水平表見表1，正交實驗安排及結(jié)果見表2，方差分析表見表3。

根據(jù)正交試驗的結(jié)果(表2)可知，影響HP-β-CD包合工藝的因素順序是C>A>B，最佳包合工藝為A2B3C2，即揮發(fā)油與HP-β-CD 比值為1∶10，加2倍量水，包合2 h。由表3方差分析可知揮發(fā)油與環(huán)糊精之比及包合時間對包合工藝有顯著影響(P<0.05)。

表1 研磨法HP-β-CD包合正交試驗因素水平

表2 研磨法制備包合物正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

F0.05(2，2)=19

2.4.2 攪拌法包合物的制備 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)〔11〕和正交實驗結(jié)果篩選出攪拌法的最佳包合工藝：取HP-β-CD 12 g，加蒸餾水15 ml，置溫度為30℃的磁力攪拌器上，攪拌，緩慢滴入1 ml揮發(fā)油(此揮發(fā)油用無水乙醇溶解，揮發(fā)油∶無水乙醇=1∶1，V/V)，包合2 h，取出冷卻至室溫，于冰箱中冷藏(24 h)，抽濾，用環(huán)己烷洗滌3次，每次10 ml洗去未包合的揮發(fā)油，40℃條件下真空干燥4 h，取出，備用。

2.4.3 最佳工藝確定 分別用篩選的最佳工藝平行做3次實驗，根據(jù)“2.3”方法計算包合物含油率、收得率及揮發(fā)油包合率，實驗結(jié)果，攪拌法3組驗證實驗結(jié)果各指標(biāo)的平均值分別為3.31%、80.51%、54.17%，研磨法3組驗證實驗結(jié)果的平均值為7.11%、80.61%、98.44%。由此可確定選用研磨法制備包合物，且該方法制備包合物的綜合指標(biāo)平均值為0.95，比正交表中9組實驗評分結(jié)果都高。因此，本研究篩選出的研磨法制備包合物最優(yōu)工藝條件A2B3C2合理、穩(wěn)定、可行。

2.5 HP-β-CD 包合物的驗證

2.5.1 薄層色譜法(TLC) 稱取 HP-β-CD約0.1 g，用1 ml無水乙醇超聲15 min，離心后取上清液，即得供試液1；稱取包合物0.1 g，同上處理，即得供試液2；精密移取白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油0.1 ml，用無水乙醇(1∶1，V/V)稀釋溶解，作為供試液3；取適量包合物用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，精密移取0.1 ml，同上處理，即得包合后所提揮發(fā)油供試液4；將揮發(fā)油與HP-β-CD物理混合，用5 ml無水乙醇超聲溶解，離心后取上清液，即得供試品溶液5。吸取上述供試品溶液各10 μl，點于硅膠G薄層板上，以石油醚(60℃～90℃)-乙酸乙酯(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%香草醛濃硫酸溶液，105℃烘干至斑點清晰，見圖1。結(jié)果：HP-β-CD供試液1和包合物供試液2均未見與供試液3、4、5相同的斑點出現(xiàn)，說明包合物已形成，且其表面無殘留的揮發(fā)油。包合物供試液2沒有顯示與揮發(fā)油溶液3相同的斑點，而二者物理混合物即供試液5則與供試液3有類似斑點，說明包合物中揮發(fā)油與HP-β-CD并非簡單的物理混合作用；而經(jīng)包合物從新蒸餾得出的揮發(fā)油即供試液4與供試液3在相應(yīng)的位置上分別顯有斑點，且Rf值和顏色基本一致，證明在外界條件劇烈時，揮發(fā)油可從環(huán)糊精空腔中游離出來，且主要成分并未改變，即包合作用是可逆的。

2.5.2 紫外分光光度法(UV) 樣品1、2、3、4、5于200～400 nm范圍內(nèi)作紫外掃描，見圖2。結(jié)果：1、2樣品無揮發(fā)油的特征吸收峰，而供試液 3、4、5在相同位置上有混合揮發(fā)油類似的吸收峰。說明揮發(fā)油已被HP-β-CD包合在空腔結(jié)構(gòu)中并已經(jīng)構(gòu)成一種新的物相，且HP-β-CD表面無殘留揮發(fā)油。同樣亦可佐證揮發(fā)油包合前后主要成分的理化性質(zhì)并無改變。

1：HP-β-CD；2：包合物；3：混合揮發(fā)油；4：包合物中所提揮發(fā)油；5：揮發(fā)油與HP-β-CD物理混合物圖1 包合物驗證的TLC圖

圖2 包合物驗證的UV圖

3 討 論

實驗中提取的白術(shù)、桂枝混合揮發(fā)油經(jīng)包合后可有效防止其揮發(fā)，減少了與外界接觸，增加其穩(wěn)定性，避免了傳統(tǒng)工藝直接加入的弊端。之所以采用HP-β-CD對所提混合揮發(fā)油進(jìn)行包合，是由于HP-β-CD是β-CD的C2、C3、C8位的羥基被羥丙基取代生成的衍生物，其水溶性更大。當(dāng)揮發(fā)油被HP-β-CD包合之后可以明顯增加難溶性藥物的溶解度，有利于制備液體藥劑。

基于HP-β-CD具有較強(qiáng)的吸濕性，因此對原料及其包合物要密封保存、注意防潮。

由于揮發(fā)油的溶解性差，在HP-β-CD溶液中無法溶解，制備時可先將其溶于少量適宜有機(jī)溶劑中，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯。考慮到生產(chǎn)實際的安全性、制劑過程中無毒性，宜首選乙醇作為揮發(fā)油的溶媒。實驗中將揮發(fā)油乙醇溶液緩慢地邊加邊研磨滴入HP-β-CD溶液，目的是使其均勻分散，便于二者的相互作用。

HP-β-CD包合物的制備方法主要有攪拌法、研磨法、超聲法，本研究只篩選了攪拌法和研磨法的最佳工藝。一是出于節(jié)能、省時、利于大生產(chǎn)考慮；二是使用超聲法在制備包合物的預(yù)實驗過程中發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油在水中的溶解性低而分散漂浮于水面，超聲作用力小，使揮發(fā)油與HP-β-CD分子接觸的機(jī)會少，致?lián)]發(fā)油分子難以進(jìn)入HP-β-CD分子腔中。因此，超聲法包合白術(shù)、桂枝揮發(fā)油的效果不理想，故不予采用。

實驗中采用攪拌法和研磨法對白術(shù)、桂枝所提混合揮發(fā)油進(jìn)行包合后發(fā)現(xiàn)，研磨法制備的包合物粉末均勻、細(xì)膩，包合物效果更理想。究其原因可能是研磨過程中研磨力使HP-β-CD與揮發(fā)油充分接觸，將揮發(fā)油分子擠入HP-β-CD分子腔中，故其包封效果更好。

本研究進(jìn)行的空白回收率試驗，所測量值偏低，可能是由于在水蒸氣蒸餾的過程中揮發(fā)油有一定程度的散失，且部分乳化及黏附在器壁上所致，有待于進(jìn)一步完善提高。

1 劉 萍，張麗萍.桂枝化學(xué)成分及心血管藥理作用研究〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2012；39(10)：1926-7.

2 劉 蓉，何 婷，曾 南，等.桂枝揮發(fā)油及桂皮醛抗流感病毒的機(jī)制研究〔J〕.中草藥，2013；44(11)：1460-4.

3 許祥君，陳 敏，宗 露，等.不同品規(guī)白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ的含量測定〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011；31(17)：1421-4.

4 蒲含林，王正濂，黃巧娟，等.雙白術(shù)內(nèi)酯對豚鼠離體心房肌的作用〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2000；16(1)：60-2.

5 宋更申，馮 麗，裴麗娟，等.藥用輔料羥丙基-β-環(huán)糊精的研究概況〔J〕.中國藥房，2011；22(45)：4292-4.

6 劉 宇，殷中瓊，魏 琴，等.油樟葉揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備工藝研究及穩(wěn)定性考察〔J〕.中國中藥雜志，2013；38(13)：2105-8.

7 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010 年版一部〔S〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

8 楊 明.中藥藥劑〔M〕.第3版.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：428.

9 江維維，范慶龍，徐殿紅.超臨界提取芪葛口服液揮發(fā)油的包合工藝研究〔J〕.中國處方藥，2010；13(6)：40-1.

10 魏小亮，胡久梅，毛 霞.正交設(shè)計法優(yōu)選川芎揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合工藝〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011；17(5)：46-8.

11 詹國平，郝 麗.艾葉揮發(fā)油-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備〔J〕.合成化學(xué)，2010；18(4)：493-6.

〔2016-06-08修回〕

(編輯 袁左鳴)

河北省科技支撐計劃項目(No.15272701D)

李春花(1965-)，女，碩士，教授，主要從事中藥制劑新技術(shù)、新方法研究。

王紅芳(1974-)，女，講師，主要從事抗菌藥物致細(xì)菌內(nèi)毒素釋放和中藥制劑生產(chǎn)工藝及質(zhì)量分析。

R283

A

1005-9202(2017)06-1327-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.010

1 河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院