套細胞淋巴瘤細胞Toll樣受體9的表達及意義

李 爽 楊 陽 安倍瑩 劉曉會 吳 靜 白元松 崔久嵬 陳京濤

(吉林大學第一醫院轉化醫學研究院，吉林 長春 130061)

套細胞淋巴瘤細胞Toll樣受體9的表達及意義

李 爽 楊 陽 安倍瑩1劉曉會2吳 靜 白元松3崔久嵬4陳京濤

(吉林大學第一醫院轉化醫學研究院，吉林 長春 130061)

目的 觀察套細胞淋巴瘤細胞Toll樣受體(TLR)9的表達及意義。方法 采用PCR檢測TLR9基因的表達，采用流式細胞術檢測TLR9蛋白的表達，采用免疫組化檢測淋巴瘤患者淋巴結TLR的表達。采用Annexin V/PI雙染檢測CpG誘導套細胞淋巴瘤細胞的凋亡情況。結果 在套細胞淋巴瘤細胞系，TLR9基因水平和蛋白水平均高表達。套細胞淋巴瘤患者的淋巴結TLR9也有明顯的表達。CpG-B刺激套細胞淋巴瘤細胞系后凋亡比例明顯上升，并且具有時間和濃度依賴性。結論 TLR9在套細胞淋巴瘤細胞系高表達，CpG-B能夠誘導套細胞淋巴瘤細胞凋亡。

Toll樣受體；套細胞淋巴瘤；CpG寡聚核苷酸；凋亡

套細胞淋巴瘤(MCL)多發于中老年，男性患者居多，長期生存率低。傳統MCL的治療方法是化療及放療〔1，2〕,目前仍無明確的MCL治療標準〔3〕。

模式識別受體(PRR)是天然免疫中十分重要的免疫受體，能夠識別各種病原體〔4〕，引起快速免疫應答。Toll樣受體(TLR)是PRR的一種〔5〕。研究表明TLRs在大多數血液系統惡性腫瘤中均有不同程度的表達,包括 B 系淋巴瘤細胞和骨髓瘤細胞等，具有重要的生物學效應〔6,7〕。CpG寡聚核苷酸(CpG-ODN)是TLR9的激動劑。CpG是一組從細菌 DNA 中提取的非甲基化的富含胞嘧啶鳥嘌呤的核苷酸序列〔8〕，主要分三型，A型主要活化漿細胞樣樹突細胞(pDCs)，B型主要活化B細胞〔9〕,C型是出現較晚的一種亞型，兼具A型和B型的活性〔10〕。NCL屬于B細胞淋巴瘤，因此本研究主要選用B型CpG〔11,12〕。有研究報道，CpG-B能夠誘導白血病細胞的凋亡〔13〕。本研究探討MCL細胞TLR9的表達及意義。

1 材料和方法

1.1 細胞株及細胞培養 SP53，JEKO-1，G519，MINO，JURKAT細胞株均為ATCC購買并在本實驗室保存。細胞培養基配制為RPMI1640(Corning公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，1%雙抗 (Hyclone公司)。細胞株置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱培養，細胞為懸浮細胞系，不需胰酶消化，隔天傳代即可。選對數生長期細胞進行實驗。

1.2 qPCR檢測 收集對數生長期SP53，JEKO-1，G519，MINO、JURKAT細胞1×106，選用EASY PureTMRNA試劑盒(北京全式金公司)提取RNA。再選用TranscriptTM兩步法RT-PCR Super Mix試劑盒(北京全式金公司)將mRNA逆轉錄成cDNA。利用酶標儀檢測cDNA的純度和濃度，A260/280比值均介于1.8～2.0之間。將cDNA進行PCR擴增，擴增參數為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行35個循環；然后72℃延伸5 min。將擴增后的cDNA用于不同細胞株的瓊脂糖凝膠電泳實驗。同時將cDNA進行TLR9 qPCR實驗，擴增參數為：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火30 s，進行40個循環。擴增引物：TLR9上游引物：5' TACCAACATCCTGATGCTAGACTC 3'，下游引物：5'TAGGACAACAGCAGATACTCCAGG3'。

1.3 流式細胞儀檢測 收集對數生長期的SP53，JEKO-1，G519，MINO細胞，離心1 200 r/min,5 min。細胞計數5×105/管，用破膜液200 μl (BD公司) 將細胞團吹散，室溫避光孵育20 min；取400 μl破膜緩沖液洗滌兩遍，分別用TLR9抗體，同型對照(BD公司)抗體染色，室溫避光孵育30 min，將染好的細胞洗滌兩遍，流式細胞儀檢測。采用Flowjo流式分析軟件分析結果。

1.4 凋亡檢測 收集對數生長期的SP53，JEKO-1，G519，MINO細胞，1×105/孔鋪于24孔板，分別用CpG-B(CpG684,CpG2006,購自Invitrogen公司) 刺激細胞,各時間點利用Annexin V/PI試劑盒(BD公司)對細胞進行染色，流式細胞儀檢測。CpG684序列：5'-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3'，CpG2006序列：5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'。

1.5 免疫組化檢測 取MCL患者淋巴結的病理切片，置于60℃恒溫箱中放置1 h；分別在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15 min，進行脫蠟，乙醇進行水化后，洗滌3遍；再加熱至沸騰的檸檬酸鹽緩沖液15 min進行抗原修復，水洗兩遍，PBS洗滌3遍；將組織切片在3%甲醇-H2O2中室溫浸泡10 min，再用生物素阻斷劑試劑盒進行封閉；一抗4℃過夜，PBS洗3遍；用生物素化二抗工作液在37℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌3遍；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌3遍；DAB顯色，封片；鏡下觀察(20×)。

1.6 統計學方法 采用Graph Prism5.0軟件對數據進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1 MCL細胞TLR9 mRNA表達 在SP53，JEKO-1，G519，MINO四種B細胞系TLR9 mRNA均有表達,陰性對照組T細胞系JURKAT的TLR9 mRNA表達量則很低，其中JEKO-1和MINO細胞上TLR9表達水平較SP53和G519高，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測不同細胞系TLR9 mRNA表達

2.2 MCL細胞TLR9蛋白表達 SP53、JEKO-1、G519、MINO細胞中TLR9的平均熒光強度(分別為1 203、1 560、1 315、1 487)高于同型對照(分別為985、902、013、898)，差異有統計學意義(P<0.05)。 JEKO-1，MINO兩種細胞系TLR9的表達量較SP53，G519高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 免疫組化結果 正常淋巴結組織結構清晰，而MCL患者的淋巴結輪廓不清晰，組織結構被破壞，有大量棕褐色的陽性結果，說明TLR9在MCL細胞上高表達。見圖2。

圖2 TLR9表達的免疫組化結果(DAB，×200)

2.4 不同濃度CpG-B刺激TLR9誘導MCL的凋亡 本實驗選用四種MCL細胞系SP53、JEKO-1、G519、MINO，99%以上細胞均為CD19+的B細胞，細胞系純度滿足實驗要求。與陰性對照組相比，B型CpG684和CpG2006均能誘導MCL細胞的凋亡。在SP53，JEKO-1細胞系中，隨著CpG684的濃度增加，誘導細胞凋亡的趨勢增加，表明CpG-B能夠誘導MCL細胞的凋亡，在SP53，JEKO-1細胞系中凋亡具有濃度依賴趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.5 不同時間CpG-B刺激TLR9誘導MCL的凋亡 在CpG-B刺激MCL 1,3,5 d后，細胞凋亡比例明顯增加。在MINO細胞系中，隨著刺激時間的增加，CpG2006和CpG684誘導MCL細胞凋亡的比例呈增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

細胞系陰性對照組CpG6841μmol/LP值1)2μmol/LP值1)5μmol/LP值1)CpG2006(5μmol/L)P值1)SP5387.23±7.93079.42±7.2200.542272.16±6.5600.280770.62±6.420.245167.98±6.1800.1956JEKO-199.77±9.07094.16±8.5600.696990.09±8.1900.511386.79±7.8900.393294.82±8.6200.7306G51977.88±7.08068.31±6.2100.416567.32±6.1200.376370.51±6.4100.521065.67±5.9700.3181MINO89.32±8.12080.74±7.3400.515284.48±7.6800.707276.45±6.9500.351734.54±3.1400.02431)

1)與陰性對照組比較，下表同

時間點SP53陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)JEKO-1陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)1d84.15±7.65077.11±7.0100.567476.67±6.9700.544997.35±8.85092.73±8.4300.741889.10±8.1000.56273d85.69±7.79078.10±7.1000.546275.24±6.8400.419692.07±8.37077.11±7.0100.304177.66±7.0600.31885d77.11±7.01053.46±4.8600.109246.53±4.2300.0648100.8±9.16076.89±6.9900.174176.34±6.9400.1675時間點G519陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)MINO陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)1d76.89±6.99068.20±6.2000.450566.99±6.0900.397484.48±7.68084.04±7.6400.971382.28±7.4800.85643d73.15±6.65062.48±5.6800.346866.33±6.0300.526875.35±6.85073.26±6.6600.847171.28±6.4800.70815d78.32±7.12058.52±5.3200.155860.50±5.5000.186275.02±6.82053.90±4.9000.128462.70±5.7000.3000

3 討 論

MCL是由體細胞基因突變引起的，B細胞大量擴增，病因不明。MCL多見于60歲左右的老年人，常規的治療手段痛苦較大，復發率高且生存率低，并不適用于老年人。在國外，一些國家采用干細胞移植的方式，但這種治療手段配型成功率低，且價格昂貴，普遍性受到限制。目前比較受關注的治療方式有靶向治療的生物制劑和免疫治療，已有靶向藥物進入臨床試驗〔14,15〕。但免疫治療仍在研究中，人們期待能找到一種有效，可靠的MCL治療方法。本研究結果表明，MCL腫瘤細胞高表達TLR9，TLR9的激動劑CpG-B能夠誘導MCL凋亡。本文發現，SP53在第3天時出現明顯凋亡，JEKO-1在第5天時出現明顯凋亡，G519整體凋亡趨勢不明顯，MINO的凋亡具有時間依賴性，造成這種差異的可能因素有：①由細胞自身特性決定的，細胞系大多從病人體內分離得到，病人的個體差異使細胞系之間存在差異；②細胞成系較早，細胞的特性可能會發生一些改變，本實驗中已對細胞純度進行驗證；③細胞培養時的狀態會存在差異。若想確定凋亡是否具有CpG-B刺激時間或濃度依賴性，還需進一步研究驗證。CpG在白血病中的應用頗受爭議〔16，17〕，有文章報道稱在CpG刺激白血病的腫瘤細胞后，能夠促進腫瘤細胞的增殖，并稱這一發現對于白血病的微量診斷具有重要意義〔18，19〕。也有研究顯示白血病細胞能夠表達TLR9，用TLR9的激動劑刺激后能夠誘導腫瘤細胞的凋亡，對于白血病的治療有重要意義〔13〕。本實驗表明在MCL中TLR9的激動劑CpG-B能夠誘導腫瘤細胞的凋亡。本實驗為套細胞淋巴瘤的治療提供了有力的依據，主要有以下兩點：①TLR9在MCL上高表達，為MCL的治療提供了新的靶點；②CpG-B能夠誘導MCL的凋亡，可作為MCL免疫治療靶向藥物。

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〔2016-03-21修回〕

(編輯 曹夢園)

Expression and significance of Toll like receptor 9 on mantle cell lymphoma

LI Shuang,YANG Yang,AN Bei-Ying,etal.

Institute of Translational Medicine,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130061,Jilin,China

Objective To explore expression and significance of Toll like receptor (TLR) 9 on mantle cell lymphoma (MCL).Methods MCL cell lines SP53,JEKO-1,G519,MINO and JURKAT were studied.The mRNA or protein expression of TLR9 on MCL cell lines were distinguished by PCR,flow cytometry,and immunohistochemistry.The apoptosis of MCL cell lines was induced by CpG-B treatment and detected by Annexin V and PI staining.Results The expression of TLR9 on MCL cell lines was examined.TLR9 were strongly expressed on the MCL cell lines and lymph nodes from MCL patients.CpG-B,the ligand of TLR9 could induce the apoptosis of MCL cells,which was dose and time dependent.Conclusions MCL cells showed high expression of TLR9,CpG-B could induce tumor apoptosis.

Toll like receptor 9;Mantle cell lymphoma;CpG;Apoptosis

國家自然科學基金(81571534)；吉林省科技發展計劃項目(國際合作項目)(3D512K213428)；吉林省發展與改革委員會項目(2014N147)；吉林省科技廳國際合作項目(20140414014GH)

陳京濤(1967-)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤免疫學研究。

李 爽(1989-)，女，碩士在讀，主要從事腫瘤免疫學研究。

R73-36

A

1005-9202(2017)06-1310-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.004

1 吉林大學第一醫院檢驗科 2 安陽市腫瘤醫院

3 吉林大學中日聯誼醫院腫瘤血液科

4 吉林大學第一醫院腫瘤中心