慕薩萊思復配發酵劑的實驗室研制

張佳斌，王冠群，陳彤國，馬泉，朱麗霞*

（塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

慕薩萊思復配發酵劑的實驗室研制

張佳斌，王冠群，陳彤國，馬泉，朱麗霞*

（塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

針對傳統慕薩萊思工藝發酵時間長、發酵過程不易控制，產品穩定性不足等缺陷，該研究對175株慕薩萊思酵母進行單株培養，初篩出具有優良香氣特征的2株疑似釀酒酵母和20株非釀酒酵母，再進行不同菌株、不同比例復配，不同時序接種，微型發酵驗證，獲得一組復配菌N8∶F10（2∶1）。其釀制酒的降糖幅度（18°Bx）、CO2釋放量（11.86 g/50 mL）、香氣（2.22分）及口感（1.65分）優于商用菌株RV100，所釀制的酒殘糖3.43 g/L、總酸1.97 g/L、酒精度11.66%vol，具有慕薩萊思紅棕色澤、典型香氣和口感特征，可作為慕薩萊思規模化生產的潛在優良發酵劑。通過WL形態和5.8-ITS鑒定，菌株N8為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌株F10為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。該研究為慕薩萊思傳統工藝改進及產品品質提高奠定了基礎。

慕薩萊思；復配發酵劑；同步接種；香氣；口感

慕薩萊思是新疆具有民族風味的傳統飲品[1]，具有增強人體免疫功能、降血脂、抗衰老等保健功能[2]。慕薩萊思工藝獨特，將地方和田紅葡萄，經過壓榨取汁、濃縮、自然發酵而形成，傳統釀造中表現出周期長、不易控制和產品品質不穩定等先天性不足。香氣是評定葡萄酒品質的重要指標之一，葡萄酒中已超過400種揮發性成分是酵母發酵產生，不同酵母產生的香氣成分不同[3-4]。葡萄酒發酵方式有純種發酵與混菌發酵，純種發酵菌株單一，污染少，其香氣成分較少，而混復配菌發酵有多菌種共生，酶系豐富，會產生多種香氣成分[5]。多菌種發酵是當前研究熱點，其中非釀酒酵母被廣泛運用于葡萄酒、白酒等行業，在釀造過程中有著極其重要的作用[6]。非釀酒酵母與釀酒酵母相互作用可賦予葡萄酒獨特的濃郁香味與發酵香味，提高酒體品質[7-9]。

該研究旨在從菌庫中篩選得到釀酒酵母與非釀酒酵母并進行不同菌株、不同比例及不同時序的復配，最終獲得適合新疆特色慕薩萊思釀造用葡萄酒的復配發酵劑，縮短傳統工藝發酵時間、提高成品品質，為慕薩萊思規模化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

和田紅葡萄汁濃縮液（即慕薩萊思發酵液）：取自刀郎慕薩萊思有限公司；優質慕薩萊思（商品名為慕薩萊思之鄉）：刀郎慕薩萊思有限公司贈；分離于慕薩萊思釀造生境的9株疑似釀酒酵母（YSc，編號為N1～N9）與166株非釀酒酵母（NSc，編號為F1～F166）：保藏于塔里木大學食品系；活性干酵母（釀酒酵母RV100）：安琪酵母公司；WL營養瓊脂培養基：青島日水生物有限公司。

1.2 儀器與設備

WYT-4手持糖度儀：上海精密儀器儀表有限公司；HPX-9162 MBE恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；JA5003電子天平：上海菁海儀器有限公司；MYCYCLER基因擴增儀：美國ABI Veriti公司；島津GC-2014氣相色譜儀：島津國際貿易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復配發酵劑的研制

（1）復配菌株初篩

取9株YSc和166株NSc活化液接入50 mL薩萊思發酵液中，接種量為1%，置于（28±1）℃的培養箱中連續培養7 d，以未接菌的發酵液與成品酒作為標準，對接菌發酵后的樣品只進行香氣濃郁度評分，選出香氣優良2株YSc和20株NSc備用。

（2）復配菌復篩

分別將初篩得到優良YSc和NSc經二次活化后按照1∶1進行復配，接種量均為1%，接入慕薩萊思發酵液中于（28±1）℃條件下恒溫培養7 d，期間進行發酵樣品的糖度及質量變化的監測，計算CO2釋放量。發酵結束后進行香氣濃郁度評分（香氣濃郁度篩選標準同初篩）并結合降糖幅度（初始糖度-發酵結束時殘糖量）與CO2生成量綜合分析篩選優良復配菌3株。

（3）復配菌的復配比例篩選

將挑選出來的優良復配菌按照YSc∶NSc的不同比例接種（接種量分別為1%∶0.5%、1%∶1.0%、1%∶1.5%、1%∶2.0%、1%∶2.5%）經二次活化12 h后進行復配接種，置于（28±1）℃條件下恒溫培養7d，期間進行糖度與三角瓶質量變化監測，并計算CO2釋放量，發酵結束后只進行香氣濃郁度評定。根據降糖幅度、CO2生成量和香氣濃郁度評定的綜合分析確定最佳復配比例。

（4）微型時序接種發酵實驗

將篩出的復配菌株組按照不同時間段接入后進行發酵（N8-F10同時接入共同發酵、菌株N8發酵高泡期時接入菌株F10進行發酵，菌株F10發酵高泡期時接入菌株N8進行發酵、菌株N8與F10單獨發酵），對各樣品酒進行感官評定，包括香氣濃郁度、口感和色澤的評分，確定最佳接種時序。

1.3.2 微型發酵驗證試驗

將挑選最優復配菌按照最優比例接至50 mL慕薩萊思發酵液，以安琪酵母RV100為參考菌，置于（28±1）℃恒溫培養，對發酵結束樣品進行總酸、總糖和酒精度測定以及感官評定，以證明所篩選目的菌株發酵結束樣品的品質符合慕薩萊思成品。

1.3.3 相關指標的測定

（1）糖度測定

采用手持糖度儀測定糖度變化，發酵期間每隔1 d測定糖度，直至糖度穩定，確定為發酵結束。

（2）CO2生成量測定

CO2失重法[10]：記錄樣品初始質量，在發酵過程中每隔1 d測定樣品質量，直至發酵結束（糖度穩定），樣品減少的質量即為CO2生成量，發酵結束后測定其最終CO2生成量。

（3）酸度測定

根據國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》采用指示劑法測定發酵結束樣品的總酸[11]。

（4）乙醇測定

乙醇含量的測定采用氣相色譜法，檢測器：SFID1；色譜柱：毛細管柱wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；檢測器溫度230℃，柱溫230℃，柱箱溫度40℃；氣體：N2（載氣）、氫氣和空氣；分流比為100∶1，進樣體積1.0 μL。配制體積分數分別為2%、4%、8%、12%、16%、20%的乙醇溶液，以乙醇體積分數為X軸，峰面積為Y軸制作標準曲線為Y= 484 419X+59 170（R2=0.999 4）。

（5）感官評定

初篩與復篩只進行一輪香氣濃郁度評定（按照香氣濃郁度弱、稍弱、平均、稍強、強的分值分別為0～2、2～4、4～6、6～8、8～10）。菌種接種配比與微型時序發酵試驗進行二輪感官評定包括香氣、口感和色澤的評定。感官評分標準見表1（取平均值，滿分10分）。感官評定數據進行統計得分，標準化[12]后利用SPSS進行方差分析及繪制均值圖。

表1 發酵產品香氣得分感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of the fermentation product

對微型發酵實驗樣品進行第三輪廠內感官評定包括香氣（濃郁度、協調性、優雅細膩度、復雜性、持久性、發展變化）、口感（平衡度、協調性、酒體、圓潤度、清爽度、純凈度、復雜性、口香品質、余味）、整體風味特征（香氣和口感的整體協調性、整體品質與風格和典型性）三個指標以5分尺度進行評定（各小分項的評定標準為弱、稍弱、平均、稍強、強，其分值分別為1、2、3、4、5）（評價標準由慕薩萊思廠家提供的內部資料）。

（6）復配菌株鑒定

總DNA的提取采用凍融法提取DNA[13]；5.8-ITS PCR擴增[14]并委托上海生物工程有限公司進行測序，測序結果在Genbank數據庫進行BLSAT相似性比對，相似度＞99%即可確定其菌屬[14]。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

2.1.1 優良復配菌的初篩結果

將9株YSc與166株NSc初篩發酵樣品香氣評定得分數據標準化，進行方差齊性檢測和組間（各菌株發酵酒之間）分析，得到YSc之間差異顯著（P＜0.05），NSc之間的樣品差異極顯著（P＜0.01）。

9株YSc香氣得分前2名的為菌株N8和N7（得分均值分別為6.6、6.0），2株菌的發酵產氣速率分別為8 h內產氣1/2杜氏管和1/3杜氏管，證明2株菌具有良好的生長特性。166株NSc中，篩選8h內產氣量達到1/3或1/4杜氏管且香氣得分前20的菌株，分別為F129、F148、F1、F9、F40、F25、F44、F49、F10、F120、F36、F115、F52、F161、F164、F60、F163、F166、F6、F19。

2.1.2 優良復配菌的二次篩選結果

2株YSc與20株NSc分別按1∶1復配發酵結束，以降糖幅度和CO2產生量為主以香氣評定為輔進行評價，結果分別見圖1～圖3。

圖1 2株疑似釀酒酵母與20株疑似非釀酒酵母復配發酵慕薩萊思Fig.1 Sugar content decreases of Msalais fermented by compound strains of 2 suspectedSaccharomycesspp.and 20 suspected non-Saccharomycesspp.

圖2 2株疑似釀酒酵母與20株疑似非釀酒酵母復配發酵慕薩萊思的CO2產生量Fig.2 CO2production of Msalais fermented by compound strains of 2 suspectedSaccharomycesspp.and 20 suspected non-Saccharomycesspp.

圖3 2株疑似釀酒酵母與20株疑似非釀酒酵母復配發酵慕薩萊思的香氣評定結果Fig.3 Aroma evaluation score of Msalais fermented by compound strains of 2 suspectedSaccharomycesspp.and 20 suspected non-Saccharomycesspp.

以降糖幅度和CO2產生量為主以香氣評定為輔進行評價，得出以下3組最佳復配菌，分別是N7-F10（降糖幅度排名第4、CO2產生量第4、香氣評定排名第9）、N7-F40（降糖幅度排名第4、CO2產生量排名第12、香氣評定排名第9）、N8-F10（降糖幅度排名第2、CO2產生量排名第1、香氣評定排名第5），以上三組復配菌株在發酵能力及香氣馥郁度均優于其他組合，為后續篩選提供依據。

2.1.3 YSc菌和NSc菌最優復配比例篩選

二次篩選出來的三組復配菌株按照疑似釀酒酵母與非釀酒酵母不同比例復配進行慕薩萊思釀制，在接入菌株后開始每隔1 d測定糖度與三角瓶質量變化并且計算CO2產生量，得到降糖幅度、CO2產生量和產香得分結果分別見圖4～圖6。

圖4 三種復配菌不同比例復配發酵慕薩萊思的降糖幅度Fig.4 Sugar content decreases of Msalais fermented by compound strains with different ratios

圖5 三種復配菌不同比例復配發酵慕薩萊思的CO2釋放量Fig.5 CO2production of Msalais fermented by compound strains with different ratios

圖6 三種復配菌不同比例發酵慕薩萊思的香氣評定Fig.6 Aroma evaluation score of Msalais fermented by compound strains with different ratios

15個處理中，以能夠順利啟動發酵為主，香氣得分經SPSS分析，在前3名的處理（N8-F10 1∶0.5、N8-F10 1∶1、N8-F10 1∶1.5）間進行篩選，得出N8-F10=1∶0.5為最好配比，CO2產生量為4.54 g/50 mL（第3），香氣得分均值為5.71（得分第1），降糖幅度為23°Bx（并列第1）。

2.2 菌株N8與F10微型時序接種發酵實驗

以不同時間段為變量，按照相同的接種量接入菌種，篩選最佳接種順序，發酵結束樣液的感官得分見表2。

由表2可知，對發酵結束樣品進行感官評定，對其色澤單獨分析得到菌株F10G和N8-F10的試樣評分第1，香氣與口感單獨分析均得到菌株N8-F10評分第1、菌株N8單獨培養評分第2、菌株F10G評分排名第3。綜合以上指標分析，最優復配順序為菌株N8與F10同步接入。

表2 N8和F10微型時序接種發酵與單獨接種純發酵的慕薩萊思樣品感官評定Table 2 Sensory evaluation score of Msalais fermented by strains N8 and F10 sequence combined fermentation and pure fermentation

2.3 微型發酵驗證實驗結果

以安琪商用菌株RV100為對照組，檢驗實驗中所選復配菌（其條件為同時接入2%N8-1%F10，（28±1）℃恒溫培養）的可行性，以菌株N8與F10同時接入發酵，接菌量為2%∶1%；活性干酵母RV100接種量0.1 g/100 mL。對兩者的CO2產生量、發酵結束樣品的理化檢測、香氣、口感和綜合性評分進行分析描述，結果分別見圖7～圖10、表3。

圖7 微型發酵產品CO2產生量及降糖幅度Fig.7 CO2production and sugar content decreases of microfermentation products

圖8 菌株N8-F10及RV100微型發酵樣品香氣得分Fig.8 Aroma scores of Msalais samples by strain N8-F10 and RV100 micro-fermentation

圖9 菌株N8-F10及RV100微型發酵樣品口感得分Fig.9 Mouthfeel scores of Msalais samples by strain N8-F10 and RV100 micro-fermentation

圖10 菌株N8-F10及RV100微型發酵樣品綜合性得分均值Fig.10 Comprehensive scores mean value of Msalais samples by strain N8-F10 and RV100 micro-fermentation

表3 微型發酵產品理化指標Table 3 Physicochemical indexes of micro-fermentation products

菌株N8和F10復配、及安琪酵母RV100的微型發酵試驗中，結果表明菌株N8-F10同步接入發酵處理組的CO2產生量優于菌株RV100（見圖7）。兩處理的微型發酵慕薩萊思樣品理化指標見表2，所選復配菌發酵樣品與安琪酵母發酵樣品殘糖含量在相同范圍內，均符合干型葡萄酒[15]，且酒精度范圍在9%vol～12%vol之間，符合葡萄酒酒精含量[16]。2個微型發酵樣品的香氣差異不顯著，單項分比較，菌株N8-F10在濃郁度、協調性、優雅細膩度、復雜性、持久性優于菌株RV100，香氣得分均值2.5分，同樣優于商用菌菌株RV100（見圖8），香氣特征表現為：香氣濃郁度中等偏上，香氣類型不單調，各類香氣均衡與無明顯異味，香氣整體愉悅，但持久性較差。比較兩者口感得分的差異不顯著，單項得分比較，菌株N8-F10在平衡度、協調性、復雜性、口香品質、余味上優于菌株RV100，得分均值為3.75分，同樣優于菌株RV100（見圖9）。菌株N8-F10的香氣和口感的整體協調性、整體品質、風格和典型性得分區間為2.0～2.5，綜合性評價均優于菌株RV100（見圖10），表現為香氣和口感無明顯沖突，整體品質中等、基本具備慕薩萊思的獨特風味特征。由上述結果證明，所選菌株N8-F10（接種量為2%N8-1%F10）的同步發酵具有釀造慕薩萊思優良特性，結合生產工藝，可進一步提升其品質特性，將會為慕薩萊思規模化生產提供有價值的發酵劑。

2.4 復配菌的分子鑒定

菌株N8在WL培養基上菌落呈圓形，表面光滑，乳白色，圓形微凸，奶油狀。菌株F10在WL培養基上菌體呈灰綠色，邊緣白色，呈毛絨放射狀，表面粗糙無光澤，微凸。

對所挑選出來的兩株菌進行5.8S-ITS擴增并測序，結果與GenBank數據庫中的序列進行比較，結果（見表4）表明，菌株N8與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相似度為100%；菌株F10與庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）的相似度為99%。

表4 菌株N8和F10的鑒定結果Table 4 Identification results of strains N8 and F10

3 結論

在初步篩選中，通過對產香和產CO2釋放量測試分析，得到了產香較好，產氣較快的2株疑似釀酒酵母和20株疑似非釀酒酵母。

在復配試驗中，獲得一組復配菌N8-F10，并確定了最佳菌株復配比例為N8∶F10=1∶0.5的同步發酵，慕薩萊思釀造中體現出高的降糖幅度23°Bx和CO2生成量4.54 g/50 mL，及優良的香氣特性（感官評定得分為5.71）。

以安琪活性干酵母為對照，對復配菌組N8-F10（同步接入2%N8-1%F10，（28±1）℃恒溫培養）進行微型發酵實驗所得慕薩萊思的酒精度、殘糖含量與總酸均符合慕薩萊思標準，在香氣、口感及整體品質等方面優于商用安琪酵母RV100；具備釀制慕薩萊思的優良特性，為比較理想的慕薩萊思復配發酵劑。

通過WL形態特征及5.8S-ITS測序鑒定，得到菌株N8為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌株F10為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

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Laboratory-scale development of combined starter for Msalais production

ZHANG Jiabin,WANG Guanqun,CHEN Tongguo,MA Quan,ZHU Lixia*
(College of Life Science,Tarim University,Alar 843300,China)

Traditional Msalais fermentation has the defect of long period,hardly control and insufficient product stability.In the study,175 Msalais yeast strains were cultured individually.TwoSaccharomycesspp.strains and 20 suspected non-Saccharomycesspp.strains with better aroma characteristics were firstly screened,and then through a serial of experiments for different strains,combined proportion,sequenced inoculation,and microfermentation verification optimization,a compound strain N8∶F10 with inoculum ratio 2∶1 was screened.The compound strain had a better performance than commercial yeast RV100 in sugar decrease(18°Bx),CO2production(11.86 g/50 ml),aroma evaluation score(2.22)and mouthfeel score (1.65)during the Msalais fermentation.The residue sugar content,the total acid content,the alcohol content of fermented Msalais was 3.43 g/L, 1.97 g/L,and 11.66%vol,respectively.The Msalais wine had Msalais reddish brown color,typical aroma and taste characteristics.The compound strain was a potential starter for Msalais production.By WL morphology and 5.8-ITS sequence analysis,strains N8 and F10 were indentified as Saccharomyces cerevisiaeandPichia kudriavzeviirespectively.The study provided a foundation for the improvement of Msalais traditional fermentation process and product quality.

Msalais;compound starter;simultaneous inoculation;aroma;mouthfeel

TS262.7

0254-5071（2017）03-0115-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.024

2016-10-15

國家自然基金項目（31660460,31260393）；塔里木大學大學生創新創業訓練計劃項目（201510757002）；塔里木大學校級研究生創新項目（TDGRI201606）

張佳斌（1996-），男，本科生，研究方向為慕薩萊思優良菌篩選與應用。

*通訊作者：朱麗霞（1975-），女，教授，碩士，研究方向為食品微生物與傳統發酵食品。