固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法測定植物油中6種酚類環境激素

黃榮榮，黃金鳳*，尋知慶，林森煜，李秀英，杜偉鋒

（廣州質量監督檢測研究院，廣東廣州511447）

固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法測定植物油中6種酚類環境激素

黃榮榮，黃金鳳*，尋知慶，林森煜，李秀英，杜偉鋒

（廣州質量監督檢測研究院，廣東廣州511447）

建立了一種簡單、快速測定植物油中6種酚類環境激素（雙酚A、雙酚B、雙酚F、4-壬基酚、4-n-壬基酚、辛基酚）的固相萃取凈化-液相色譜串聯質譜的分析方法。樣品加入同位素內標后，經正己烷溶解，Carb/NH2固相萃取柱凈化，高效液相色譜分離，串聯四極桿電噴霧離子源負模式及多反應監測模式檢測。雙酚A等6種環境激素在0.40～200 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均＞0.994；方法的檢出限為0.4～0.8 μg/kg，定量限為1.2～2.4 μg/kg；平均回收率為87.9%～98.0%，相對標準偏差為4.37%～11.00%。該方法具有凈化效果好、定量準確、靈敏快速的特點，適用于植物油中雙酚A等6種環境激素的定量分析檢測。

植物油；雙酚A；壬基酚；辛基酚；固相萃取；高效液相色譜串聯質譜法

近年來，在工業、農業快速發展的同時，人類給環境帶去了一些生物機體以外的激素，這類激素被稱為環境激素[1-3]，如雙酚A、雙酚B、雙酚F、4-壬基酚、4-n-壬基酚、辛基酚就屬于常見的酚類環境激素，它們具有與雌激素類似的作用，能導致人體內分泌失調。研究表明，攝入體內的壬基酚可使精子數量減少，影響生物體正常的生殖和發育，而且壬基酚可在生物體內不斷蓄積，即使每次攝入的濃度很低，也具有相當的危害性；辛基酚和壬基酚也可能導致雌性性早熟和雄性精子數量減少及質量下降等病癥[4-7]。由于雙酚A、壬基酚等在生產生活中的廣泛使用，已在食品中檢測到了它們的存在，極大地影響了食品安全[8-9]。因此，許多國家都對雙酚A、壬基酚的使用進行了規定。此外，還設定了化妝品中、高分子材料中的雙酚A的檢測方法，但食品中雙酚A和壬基酚等的檢測方法仍未健全，只是適用于部分食品基質（如魚肉、罐頭等）。

目前，國內外對于此類環境激素的研究主要方法有液相色譜法[10-11]，液相色譜-串聯質譜法[12-13]，毛細管電泳法[14]、氣相色譜法[15]等。但是這些方法主要都是針對其他基質的（如飲用水、紡織品、涂料等），基于植物油基質的處理方法，還是比較少見。液相色譜-串聯質譜法[16]相對一般的液相色譜法來說，由于該方法不僅利用保留時間來進行定性，還利用兩對特征離子對的響應比例來對目標物進一步定性定量，所以相對其他方法來說液質聯用法具有更明顯的優勢。本實驗建立了高效液相色譜串聯質譜（high performance liquid chromatography tamdem mass spectrometry，HPLCMC/MC）法測定植物油中雙酚A、壬基酚和辛基酚等酚類環境激素的分析方法，具有準確度、靈敏度高的特點，滿足了植物油中相關物質的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種化合物標準品：雙酚A（bisphenol A，BPA）、雙酚B（bisphenol B，BPB）、雙酚F（bisphenol F，BPF）、4-壬基酚（4-nonylphenol，4-NP）、4-n-壬基酚（4-n-nonylphenol，4-n-NP）、辛基酚（octylphenol，OP）（純度均＞98%），內標物4-n-壬基酚-d4（4-n-NP-d4）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；內標物雙酚A-d4（bisphenol-A-3、3'、5、5'-d4，BPA-d4）（純度＞98%）：上海安譜科學儀器有限公司；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷（均為色譜純）：德國Merck公司；氨水（分析純）：廣州化學試劑廠；超純水（18.2 MΩ）：實驗室自制。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；4000Qtrap三重四極桿質譜儀：美國AB SCIEX公司；Milli-Q去離子水發生器：美國Millipore公司；MS3 basic漩渦混合器：德國IKA公司；Turbo LV濃縮工作站：美國Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

6種化合物用甲醇溶解，配成單標儲備液，再用甲醇配成10 mg/L混標儲備液。臨用時用甲醇稀釋成所需濃度的工作液，每個濃度工作液均含50 μg/L BPA-d4和4-n-NP-d4內標物。

內標物BPA-d4，4-n-NP-d4用甲醇配制，并用逐級稀釋成1 mg/L的內標工作液。

1.3.2 樣品處理方法

準確稱取1.0 g（精確至0.01 g）植物油，加入50 μL內標工作液，混勻，然后加入5 mL正己烷，渦旋1 min，充分混勻。將所得溶液通過已用6 mL正己烷活化平衡好的Carb/NH2固相萃取小柱，然后用6 mL正己烷淋洗，再用6 mL甲醇+丙酮（1∶1，V/V）淋洗，最后用9 mL甲醇+二氯甲烷（3∶7，V/V）洗脫，洗脫液于60℃氮吹至干后，用1mL甲醇溶解，過0.22μm尼龍膜，待測定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：MerckRP-18e色譜柱（50mm×4.6mm，5μm）；流動相：A為甲醇，B為0.05%氨水；流速：0.5 mL/min（梯度洗脫程序見表1）；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

質譜條件：電噴霧負離子模式（electrospray ionization， ESI）；電噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：500℃；霧化氣：50 psi；輔助氣：60 psi；氣簾氣：20 psi；檢測模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；6種化合物和同位素內標的監測離子對（m/z）及去簇電壓、碰撞電壓等參數見表2，每個離子對的駐留時間均為50 ms。

表2 6種化合物的質譜MRM模式優化參數Table 2 Optimized parameters of six compounds of mass spectrum MRM mode

2 結果與分析

2.1 質譜條件的確定

雙酚A等目標物結構上的酚羥基在質譜電離時易失去質子，故多采用負離子模式進行檢測。采用注射泵直接進樣方式，以5 μL/min流速將100 μg/L雙酚A等化合物標準溶液注入電噴霧離子源中，獲得6種目標化合物的分子離子峰，以該離子峰為母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子信息，選擇豐度較高的兩個碎片離子為定性、定量離子，并對各個離子對的質譜參數（如去簇電壓、碰撞能等）進行優化，使儀器的靈敏度、穩定性和分離效率均處于最佳狀態。

2.2 流動相的選擇

在分離測定雙酚A等環境激素的研究中，多采用乙腈、甲醇、水、0.05%氨水為流動相。本實驗研究了流動相對雙酚A等的分離效果，結果見圖1。

圖1 流動相對6種化合物的影響Fig.1 Effect of mobile phases on six compounds

經反復試驗，結果表明（如圖1）采用甲醇/0.05%氨水的梯度洗脫程序，對6種目標物均有更高的響應，其中對4-NP、4-n-NP、OP的響應有著明顯的提高。

2.3 色譜柱的選擇

比較了實驗室常用的色譜柱YMC-PackODS-A、Merck RP-18e的分離效果，由于2種色譜柱的耐酸堿性不同，實驗中分別采用甲醇/水，甲醇/0.05%氨水為流動相。結果見圖2。

圖2 色譜柱對6種化合物的影響Fig.2 Effect of chromatographic columns on six compounds

由圖2可知，使用Merck RP-18e時，4-NP、4-n-NP、OP的響應明顯大于使用YMC-Pack ODS-A色譜柱時的響應。這不僅是因為柱效因素導致的，還與甲醇/0.05%氨水能夠更有效地離子化有關。因此，選擇Merck RP-18e色譜柱進行分離。

2.4 固相萃取柱的選擇

本實驗選用實驗室常用的固相萃取柱，有HLB、C18、WAX、MAX、Carb/NH2等固相萃取柱。HLB是通用型的固相萃取柱，可用于酸性、中性和堿性化合物的凈化；C18固相萃取柱用于凈化非極性或極性較低的化合物；WAX和MAX是陰離子交換固相萃取柱，用于凈化離子型的化合物；Carb/NH2固相萃取柱，可去除固醇類化合物，同時可通過弱陰離子交換（水溶液）達到保留作用，當用在非極性溶液中（如正己烷），能與帶有-OH、-NH或-SH的官能團形成氫鍵。本實驗針對各個固相萃取柱的性質，通過相應的前處理，對目標物進行回收率實驗。采用5種固相萃取柱時，目標物的回收率對比結果見圖3。

圖3 不同固相萃取柱對6種目標物的回收率比較Fig.3 Comparison of recovery rates of six compounds with different solid phase extraction columns

由圖3可知，Carb/NH2固相萃取柱的回收率最好，所以采用固相萃取柱Carb/NH2。

2.5 線性范圍與檢出限

向空白樣品中添加一系列的標準溶液（其線性范圍見表3），在本實驗條件下，進行HPLC-MS/MS分析。其中BPA、4-n-NP用內標法計算，以目標物定量離子峰面積（A）和內標物的色譜峰面積Ai的比值y對相應的目標物質量濃度（x，μg/L）進行線性回歸分析。BPB、BPF、4-NP、OP用外標法計算，以目標物定量離子峰面積（A）對相應的目標物質量濃度（x，μg/L）進行線性回歸分析。得到6種目標物的線性方程。根據儀器的檢出限（limitofdetection，LOD，S/N=3）及定量限（limit of quantitation，LOQ，S/N=10），結合樣品的前處理過程，計算得到方法檢出限和方法定量限，結果見表3。

表3 6種目標物的線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 3 Linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of six compounds

由表3可知，相關系數R2均＞0.994，表明5種目標物在相應的濃度范圍內線性關系良好；方法檢出限和定量限分別在0.4～0.8 μg/kg和1.2～2.4 μg/kg之間，表明方法具有較高的靈敏度。

2.6 方法回收率與精密度

為驗證方法的準確度，按本實驗方法對陰性樣品進行了回收率和精密度試驗。稱取空白樣品18份，每份1.0 g（精確至0.01 g），分為6組，分別定量加入6種目標物，按試樣處理方法處理后進行測定，結果見表4。

由表4可知，目標物在各自添加濃度范圍內，平均回收率為87.9%～98.0%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為4.37%～11.00%（n=6）。

表4 空白樣品中6種目標物的加標回收率及精密度Table 4 Adding standard recoveries and precision degree for six compounds in blank sample

2.7 實際樣品的測定

采用本方法對從市場購買的50份植物油進行分析，其中11個樣品檢出4-NP，含量在5.81～185 μg/kg；所有樣品均未檢出其余5種目標化合物。由此可見，植物油中主要殘留著4-NP。

3 結論

對于植物油中的雙酚A等6種環境激素，尚未有國標檢測方法。本文建立了固相萃取提取凈化、高效液相色譜串聯質譜儀檢測、內標法定量的方法來測定植物油中的6種環境激素。結果表明，6種環境激素在0.40～200 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均＞0.994；方法的檢出限為0.4～0.8 μg/kg，定量限為1.2～2.4 μg/kg；平均回收率為87.9%～98.0%，相對標準偏差為4.37%～11.00%。該方法具有前處理簡單，凈化效果好、定量準確、靈敏度高的特點，可為測定植物油中的雙酚A等環境激素殘留量的檢測提供方法參考。

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Determination of six phenol environmental hormones in plant oil by solid-phase extraction coupled with HPLC-MS/MS

HUANG Rongrong,HUANG Jinfeng*,XUN Zhiqing,LIN Senyu,LI Xiuying,DU Weifeng
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,Guangzhou 511447,China)

A simple and quick analysis method was established for the determination of six phenol environmental hormones(bisphenol A,bisphenol B, bisphenol F,4-nonylphwnol,4-n-nonylphenol,octylphenol)in plant oil by HPLC-MS/MS and solid phase extraction(SPE).After addition of the isotope internal standard,the samples were dispersed with hexane and cleaned by Carb/NH2solid phase extraction column,and then analyzed by HPLC-MS/MS in the multiple reaction monitoring(MRM)mode.Under the optimal experimental conditions,the calibration curves of six phenol environmental hormones were linear in the range of 0.40-50.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.994.The limits of detection and the limits of qualification of the method were 0.4-0.8 μg/kg and 1.2-2.4 μg/kg,respectively.The mean recovery rate of six phenol environmental hormones were 87.9%-98.0%combining with the relative standard deviation ranging from 4.37%-11.00%.The method was suitable for the identification and quantification of six phenol environmental hormones in plant oil due to its simplicity and accuracy.

plant oil;bisphenol A;4-nonylphwnol;octylphenol;solid phase extraction;HPLC-MS/MS

O657.7

0254-5071（2017）03-0178-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.036

2016-12-05

黃榮榮（1986-），女，工程師，本科，研究方向為食品及相關產品檢測。

*通訊作者：黃金鳳（1979-），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品及食品相關產品安全檢測、儀器分析技術。