響應面法優化生香酵母C42增殖培養基

郭凱元，亢春雨，李志輝，徐宏偉，孫思明，任蓓蕾，馬雯，李英軍，檀建新*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北保定071001；2.河北農業大學理工學院，河北黃驊061100）

響應面法優化生香酵母C42增殖培養基

郭凱元1，亢春雨1，李志輝2，徐宏偉1，孫思明1，任蓓蕾1，馬雯1，李英軍1，檀建新1*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北保定071001；2.河北農業大學理工學院，河北黃驊061100）

在搖瓶水平上對生香酵母C42培養基進行響應面法優化。首先用單因子法篩選最優碳源、氮源及無機鹽。采用Plackett-Burman法篩選影響生香酵母C42生長的主要因素、再利用最陡爬坡試驗進行Box-Behnken設計，得到生香酵母C42的優化培養基配比。優化后的培養基組成為葡萄糖7.12%、酵母浸粉3.28%、KH2PO40.2%、(NH)2SO40.6%、NaCl 0.5%、MgSO40.03%。優化后的活菌數量可達到1.26×109CFU/mL，比優化前的活菌數7.65×108CFU/mL提高了64.7%。

生香酵母；培養基優化；響應面法

生香酵母又稱產酯酵母，主要屬于假絲酵母和產膜酵母，在發酵過程中能產生酸、酯、高級醇和醛等多種香味物質。對發酵產品的風味、質地和色澤的形成起到重要的作用[1]。目前在葡萄酒、白酒、食醋等發酵行業得到廣泛應用[2-6]。在前期工作中，本實驗室篩選到一株產酯能力較高的酵母菌C42，經鑒定為異常維克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus），具有很好的潛在應用價值[7-8]。

Plackett-Burman設計是一種的兩水平試驗設計方法，可以用最少的試驗次數從眾多的因素中高效地篩選出影響最為顯著的幾個因素[9]。響應面法則是在此基礎上，進一步對這幾個重要因子水平及其交互作用進行優化，并尋求最優的參數，與傳統優化方法相比所需的試驗組數更少。目前已成為優化試驗條件、節約試驗成本的一種十分有效的方法，廣泛應用于生產試驗和科學研究[10-11]。本試驗以生香酵母C42作為研究對象，以Plackett-Burman設計及響應面優化其培養基成分，提高酵母生物量，旨在為該菌種的后續研究和生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異常維克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）C42：河北農業大學食品科技學院微生物試驗室保存；葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂糖、KH2PO4、（NH）2SO4、NaCl、MgSO4等（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。滅菌條件：121℃、20 min。

1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；ZHWY-2102C恒溫振蕩培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；DSX-280A手提壓力滅菌鍋：上海申安儀表有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

將生香酵母C42接入YEPD液體培養基中活化2次，將活化過的菌種按以體積分數2%的接種量接入盛有各培養基的三角瓶（50 mL/250 mL），30℃、250 r/min振蕩培養20 h。

1.3.2 試驗設計

先用單因素試驗篩選出合適的碳源、氮源和無機鹽，然后用Plackett-Burman設計找出對生香酵母C42增殖有顯著影響的因子，通過最陡爬坡試驗和Box-Benhnken試驗，利用Design-Expert軟件對結果進行優化分析，獲得培養基組分的最優添加量組合。通過比較生香酵母C42在普通YEPD培養基和響應面法優化后的培養基中的生長狀況從而評價優化后的培養基[12]。

1.3.3 測定方法

比濁法：菌體生物量與吸光度值成正比，測定適當稀釋的發酵液在波長560 nm處的吸光度OD值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源種類及添加量優化

選擇添加量均為2%葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、乳糖和β-環糊精7種不同碳源替換YEPD培養基中的碳源進行酵母發酵試驗。考察不同碳源對生香酵母C42生長狀況的影響，結果見圖1。

圖1 不同碳源對酵母菌C42生長狀況的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on growth of yeast C42

由圖1可知，不同的碳源對菌株的生長有不同的影響，其中葡萄糖最適合生香酵母C42的生長，因此接下來的優化培養選擇葡萄糖作為碳源。

確定葡萄糖為最佳碳源后，考察不同葡萄糖含量對生香酵母C42生長的影響，結果見圖2。

圖2 不同葡萄糖含量對酵母菌C42生長狀況的影響Fig.2 Effects of different glucose concentration on growth of yeast C42

由圖2可知，菌液吸光度值隨葡萄糖含量的增大呈先增大后減小的趨勢，葡萄糖含量為10%時菌液吸光度值達到最大值，因此選擇葡萄糖的最適含量為10%。

2.1.2 氮源種類及添加量優化

選擇添加量均為2%酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨6種不同氮源替換YEPD培養基中的氮源進行酵母發酵試驗，考察不同氮源對生香酵母C42生長狀況的影響，結果見圖3。

圖3 不同氮源對酵母菌C42生長狀況的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on growth of yeast C42

由圖3可知，生香酵母C42既可以利用有機氮源，又可以利用無機氮源。當用酵母浸粉作單一氮源時生物量最大，其次為蛋白胨，無機氮源中硫酸銨效果最好。由于酵母浸粉和蛋白胨價格昂貴，不適宜作單一氮源，因此接下來的優化中考慮用有機氮源酵母浸粉和無機氮源硫酸銨作為復合氮源。

確定酵母浸粉、硫酸銨作為復合氮源后，考察酵母浸粉和硫酸銨含量對生香酵母C42生長狀況的影響，結果見圖4。

由圖4可知，酵母浸粉含量為2.5%、硫酸銨含量為0.5%時吸光度值達到最大值，因此選擇酵母浸粉最適含量為2.5%、硫酸銨最適含量為0.5%。

圖4 不同酵母浸粉（A）及硫酸銨（B）含量對酵母菌C42生長狀況的影響Fig.4 Effects of different concentration of yeast extract powder（A）and（NH）2SO4(B)on growth of yeast C42

2.1.3 無機鹽種類及添加量優化

選擇添加量均為0.5%硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉、硫酸鋅和磷酸二氫鉀5種不同無機鹽加入YEPD培養基中，以不加任何無機鹽的培養基為對照（CK），進行酵母發酵試驗，結果見圖5。

圖5 不同無機鹽對酵母菌C42生長狀況的影響Fig.5 Effects of different inorganic salt on growth of yeast C42

由圖5可知，硫酸鎂，磷酸氫二鉀、氯化鈉對酵母的生長均有促進作用，因此選用以上3種無機鹽進行下一步試驗的無機鹽。

硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈉含量對生香酵母C42生長狀況的影響見圖6。

由圖6可知，硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉的最適含量分別為0.5%、0.15%、0.4%。

圖6 不同濃度的硫酸鎂（A），磷酸二氫鉀（B）及氯化鈉（C）含量對酵母菌C42生長狀況的影響Fig.6 Effects of different concentration of MgSO4(A),KH2PO4(B) and NaCl(C)on growth of yeast C42

2.2 Plackett-Burman試驗

根據單因素試驗結果，采用葡萄糖（X1）、酵母浸粉（X2）、（NH4）2SO4（X3）、KH2PO4（X4）、NaCl（X5）、MgSO4（X6）6個因素作為研究對象，另外設置5項虛擬項（X7～X11），以考察誤差。每個因子選取高低2個水平，其因素與水平設計見表1，試驗設計與結果見表2。利用Design-Expert軟件分析試驗結果，結果如表3所示。

表1 Plackett Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett Burman試驗設計與結果Table 2 Design and resutls of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of Plackett-Burman experiments

由表3可知，6個因素對應響應值影響的顯著性順序為酵母浸粉＞葡萄糖＞KH2PO4＞NaCl＞MgSO4＞（NH4）2SO4，其中葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4對生香酵母C42具有顯著影響，酵母浸粉具有極顯著效應（P＜0.01），葡萄糖和KH2PO4具有顯著效應（0.01＜P＜0.05）。應針對以上3因素進行進一步優化，其他因素影響相對不顯著，呈正效應的因素維持在高水平，呈負效應的維持在低水平[13]。酵母浸粉、KH2PO4、（NH4）2SO4、NaCl為正效應，說明這4個因素在高水平時對生香酵母C42的增殖更有利，因此選取酵母浸粉、KH2PO4、（NH4）2SO4、NaCl的含量分別為3%、0.2%、0.6%、0.5%。葡萄糖、MgSO4為負效應，說明這2個因素在低水平濃度時對生香酵母C42的增殖更有利，因此選取葡萄糖、MgSO4的含量為8%、0.03%。

2.3 最陡爬坡試驗

在篩選出主要影響因素后，根據回歸方程中各顯著性因素對響應值的影響，減少葡萄糖的用量，增加酵母浸粉、KH2PO4的用量，根據這3個因素效應大小的比例確定它們的步長，設計最陡爬坡試驗，以逼近最佳響應區域[14]，試驗設計與結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計與結果Table4 Experimental design and results of the steepest ascent tests

由表4可知，當葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4含量分別為7%、3.25%、0.3%時最利于酵母生長，故以此組合試驗條件作為響應面試驗因素水平的中心點。

2.4 Box-Behnken響應面試驗

根據PB試驗設計獲得的3個重要因素及最陡爬坡試驗得到的最佳濃度分別選取3個水平，利用Design-Expert軟件進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設計，因素及水平見表5，試驗設計及結果見表6。

表5 培養基組成優化響應面試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of response surface methodology for medium composition optimization

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

利用Design-Expert軟件對試驗數據進行多元回歸分析，三元二次回歸擬合方程如下：

Y=14.54+0.12A+0.14B+0.24C-0.10AB+0.005AC+0.17BC-0.47A2-0.61B2-0.90C2。

回歸系數顯著性檢驗表7表明，模型的P值＜0.000 1，說明模型極其顯著。該模型的決定系數R2=0.983，校正決定系數R2Adj=0.961，說明該模型能解釋98.3%的響應值的變化，只有變異2.2%不能由該模型來解釋，表明預測值與實測值之間擬合度好。該模型的失擬項P=0.074 1＞0.05，可知該模型失擬不顯著[15]。變異系數（coefficient of variation，CV）的值越低表明試驗的可靠性越高，試驗中變異系數為1.68%，證明試驗結果可信。因此可用此回歸方程對試驗結果進行分析預測。方程中一次項中A和B對結果有顯著影響，C對結果具有極顯著影響；二次項A2、B2、C2對結果均有有極顯著影響，交互項中BC交互作用顯著，表明試驗因子對響應值不是簡單的線性關系，而是呈二次拋物面關系。

3個因子交互作用對活菌數影響的響應曲圖以及等高線圖見圖7。

表7 Box-Benhnken試驗回歸模型方差分析Table7 Variance analysis of Box-Benhnken tests

圖7 葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4添加量交互作用對活菌數影響的響應曲面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glucose,yeast extract and KH2PO4addition on viable counts

由圖7可以看出，隨著葡萄糖和酵母浸粉質量濃度的升高，OD560nm值表現為先升高后降低，葡萄糖和酵母浸粉對生香酵母C42的生長影響顯著，說明碳源和氮源的增加有利于生酵母C42的生長，但是過高或者過低都不利于菌株的生長繁殖，因此合適的C/N比對于酵母菌的增長繁殖至關重要。葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4中任一種組分質量濃度較低時，適量增加其他組分的質量濃度均可促進菌體的生長，但在實驗范圍內葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4質量濃度之間存在最佳值，超過最佳值后，增加任一組分的質量濃度均不能提高菌體生物量，甚至使菌體生物量有所下降，為了使生香酵母C42快速增殖并形成最大生物量，選取適宜的葡萄糖濃度、酵母浸粉濃度和KH2PO4濃度都是至關重要的。

為求得模型極值點，對回歸方程求解[16]，得出在葡萄糖7.119%，酵母浸粉3.282%，KH2PO40.2%的條件下，生香酵母C42發酵液OD560nm值的預測值最高為14.59。

2.5 驗證優化結果

為了方便實際操作，修改最佳培養基配方為葡萄糖7.119%，酵母浸粉3.282%，KH2PO40.2%，采取經過優化后的增殖培養基培養生香酵母C42，重復試驗3次，培養后生香酵母C42的發酵液OD560nm值為14.57，與模型預測結果接近，說明預測結果能較好的反映實際情況，證明了模型的有效性，優化后的的酵母活菌數達1.26×109CFU/mL。

3 結論

試驗結果證明，Plackett-Burman試驗與響應面法相結合的試驗統計方法能快速、有效地從眾多影響生香酵C42增殖的因素中篩選出比較重要的影響因素，優化條件并得到最佳培養基配比。本研究通過Plackett-Burman試驗篩選出具有顯著效果的3個因素分別為葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4。在此基礎上經最陡爬坡路徑試驗找出其峰值，快速逼近最佳值區域，利用Box-Behnken響應面法優化酵母菌培養基配方。最終確定其發酵培養基為：葡萄糖7.119%、酵母浸粉3.282%、KH2PO40.2%、（NH4）2SO40.6%、NaCl 0.5%，MgSO40.03%。在此優化的培養基中活菌數為最高（1.26×109CFU/mL），較優化前（7.65×108CFU/mL）提高了64.7%，為生香酵母C42的開發利用提供理論依據。

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Optimization of aroma-producing yeast C42 culture medium by response surface method

GUO Kaiyuan1,KANG Chunyu1,LI Zhihui2,XU Hongwei1,SUN Siming1,REN Beilei1,MA Wen1,LI Yingjun1,TAN Jianxin1*
(1.Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing,College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;2.College of Science and Technology,Hebei Agricultural University, Huanghua 061100,China)

The fermentation medium for aroma-producing yeast C42 was optimized based on response surface method.Single-factor experiments were firstly performed to select the optimal carbon source,nitrogen source and inorganic salt.The significant factors which affect the growth of aromaproducing yeast C42 were filtered out through the Plackett-Burman experiments,and then the aroma-producing yeast C42 medium formula was obtained based on the steepest ascent tests and Box-Behnken design.Based on the statistical analysis,the optimal fermentation medium compositions were glucose 7.12%,yeast extract 3.28%,KH2PO40.2%,(NH)2SO40.6%,NaCl 0.5%,MgSO40.03%.After optimization,the number of viable yeast increased from 7.65×108CFU/ml to 1.26×109CFU/ml,which increased by 64.7%.

aroma-producing yeast;medium optimization;response surface methodology

TQ92

0254-5071（2017）03-0103-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.022

2016-12-01

河北省食品科學與工程學科“雙一流”建設資金項目（2016SPGCA18）；河北省重點研發計劃項目（16275505D）

郭凱元（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：檀建新（1968-），男，教授，博士，研究方向為微生物資源開發與利用。