嗜熱鏈球菌M5-5凍干保護劑配方的優化

焦琳，鄭曉衛，屈曉宇，申彤，楊潔*

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046；2.中糧營養健康研究院生物技術中心，北京102209）

嗜熱鏈球菌M5-5凍干保護劑配方的優化

焦琳1，鄭曉衛2，屈曉宇1，申彤1，楊潔1*

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046；2.中糧營養健康研究院生物技術中心，北京102209）

為了研究不同凍干保護劑在真空冷凍干燥過程中對嗜熱鏈球菌M5-5菌體細胞的保護效果，采用單因素試驗和正交試驗，以凍干后的菌體存活率為評價指標，考察9種凍干保護劑在冷凍干燥過程中對M5-5菌體的保護效果，以期獲得最優保護劑配方。結果表明，海藻糖、甘油和脫脂乳作為單一凍干保護劑時，菌體細胞存活率分別為43.85%、47.51%和40.86%，顯著高于其他6種保護劑（P＜0.05）；通過正交試驗確定凍干保護劑的最優配方為海藻糖60 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、甘油20 g/L、脫脂乳150 g/L，此時嗜熱鏈球菌M5-5的凍干存活率可達88.41%。掃描電鏡結果顯示，添加保護劑配方組菌體細胞完整，表面光滑，說明該保護劑配方能有效減少冷凍干燥過程對菌體細胞的損傷。

嗜酸鏈球菌；凍干保護劑；掃描電鏡

目前，糖類和脫脂乳是使用較廣泛且保護效果明顯的保護劑，但其作用機理尚不明確[14]。就效果而言，單一的保護劑不足以保護菌體抵抗不良的凍干環境[15]，且同種保護劑對不同菌株的保護效果不盡相同，不同濃度的保護劑保護效果也存在差異。因此，只有復配保護劑中各組分比例和濃度達到協調時，才能達到理想的保護效果。本研究以從新疆民豐縣采集的酸乳中篩選分離的嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）M5-5為試驗菌株，采用單因素法篩選出保護效果顯著的保護劑，采用正交試驗法確定最優的保護劑的濃度和比例，并經掃描電鏡驗證該保護劑配方對菌體細胞的保護效果，以期最大限度地發揮保護作用，減少菌體細胞在凍干過程中的死亡和損傷，為高效凍干發酵劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株：本試驗室從新疆民豐縣收集的酸奶中分離得到的一株高產胞外多糖的乳酸菌M5-5，經16S rDNA鑒定，菌株M5-5為嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）。

脫脂乳粉：新西蘭恒天然集團；海藻糖、甘露醇、谷氨酸鈉：美國Sigma公司；抗壞血酸：國藥集團化學試劑有限公司；甘油、麥芽糊精、谷氨酸：北京化工廠；以上試劑均為分析純。

MRS培養基：蛋白胨10.00 g，酵母浸粉5.00 g，牛肉膏10.00 g，葡萄糖20.00 g，磷酸氫二鉀2.00 g，檸檬酸氫二銨2.00 g，無水乙酸鈉5.00 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，Tween-801.00g，蒸餾水1L，pH值為6.8，121℃滅菌15min。

1.2 儀器與設備

Alpha1-2LDplus型真空冷凍干燥機：德國CHRIST公司；BHC-1300IIA2型超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；Neofuge 23R型力康高速低溫離心機：香港力康有限公司；YX280B型手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫療器械有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）公司；GXZ型恒溫培養箱：寧波江南儀器廠；HH-S型水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；Spectrumlab24型紫外分光光度計：上海棱光技術有限公司。HITACHI S-3400型掃描電鏡：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

菌種活化→擴大培養→離心→收集菌泥→加入保護劑溶液→懸浮液的制備→預凍→真空冷凍干燥→復水→計數活菌數（CFU/mL）→計算菌體細胞存活率

1.3.2 菌株M5-5生長曲線的測定

將菌株M5-5在MRS固體培養基上劃線，放入37℃恒溫培養箱培養24 h，連續活化3次，使菌株活力達到最佳狀態。

按接種量3%接種于若干個MRS液體培養基。將其放入37℃培養。取出0 h的培養液測OD600nm值，并記錄。此后，每隔1 h測一次OD600nm值。以時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標繪制菌株M5-5的生長曲線，以確定菌株M5-5的對數生長末期和穩定生長前期。

1.3.3 菌懸液的制備和冷凍干燥

將處于對數期末期的菌株M5-5加入離心管中，4000r/min離心20 min后在無菌操作臺中迅速傾去上清液，得到細胞糊狀物（即菌泥）備用。按菌泥∶保護劑=1∶3的體積比加入滅菌保護劑，制成菌懸液備用。

各取2 mL菌懸液分裝至無菌的小西林瓶中，在-80℃預凍12 h使其完全凍結，然后轉移至真空冷凍干燥機內進行真空凍干12～15 h。利用凍干后的菌體細胞存活率來比較保護劑的效果。

1.3.4 細胞存活率計算

采用梯度稀釋傾注平板計數法，分別計算凍干前和凍干后菌體活細胞數，對于凍干后活菌數的計算，先將凍干后的菌粉加入與凍干前等體積的無菌生理鹽水復水，以MRS培養基為計數培養基，37℃培養48h后計活菌數。菌體細胞存活率計算公式如下：

1.3.5 單因素試驗

根據文獻報道，選擇9種凍干保護劑，分別為海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸、甘油、甘露醇、谷氨酸鈉、脫脂乳、抗壞血酸、MRS培養基，按菌泥∶保護劑=1∶3體積比添加凍干保護劑，以凍干后菌體細胞存活率為指標篩選出效果較好的凍干保護劑，進行下一步的試驗。

1.3.6 正交試驗

根據單因素篩選出合適的保護劑，最終選擇海藻糖、谷氨酸鈉、甘油、脫脂乳為試驗因素，以細胞存活率為評價指標，每個因素取3個濃度水平，進行正交試驗設計L9（34），正交試驗因素與水平見表1，每組試驗重復3次。

表1 凍干保護劑配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cryoprotectants formula optimization

1.3.7 掃描電鏡觀察

利用掃描電鏡觀察嗜熱鏈球菌M5-5凍干前細胞形態，及添加最優保護劑配方和未添加保護劑條件下凍干后的細胞形態，驗證最優保護劑配方對菌體細胞的保護效果。

2 結果與分析

2.1 菌株M5-5生長曲線的測定

由于菌種收獲時期會影響細胞的復蘇能力和代謝活性[16]。乳酸菌在停滯期時，不具有強的繁殖能力，且耐受力和活力較差；處于對數生長期的乳酸菌繁殖能力較強，細胞代謝活性強，適合用于擴大培養時接種，但對溫度比較敏感，不宜進行低溫處理；在處于對數末期和穩定前期的細胞，生理結構和代謝功能都處于穩定期，菌體抗逆性強，因此收獲此時的細胞作為冷凍干燥的細胞進行研究更具有代表性。

圖1 菌株S.thermophilusM5-5的生長曲線Fig.1 Growth curve ofS.thermophilusM5-5

由圖1可知，在0～3 h時，OD600nm值基本沒有變化，說明在此期間，菌種處于停滯期；從4 h開始OD600nm值增長速率加快，菌種生長進入對數期。到8 h后OD600nm值雖仍有上升趨勢，但非常緩慢，說明菌種已經逐漸進入穩定期。故選擇培養8～13 h的菌體作為凍干保護劑篩選的研究對象。

2.2 單因素試驗

保護劑效果可能與保護劑類型有關，滲透型的保護劑被認為是最理想的保護劑，如甘油既能透過細胞壁也能透過細胞膜，對菌體的保護效果明顯。而僅能通過細胞壁不能穿過細胞膜（如多糖等）效果次之[17]。本試驗選用9種保護劑，不同凍干保護劑下菌體細胞存活率計算結果見表2。

表2 不同凍干保護劑下存活率（n=4）Table 2 Cell survival rate under different cryoprotectants（n=4）

由表2可知，海藻糖、甘油和脫脂乳對菌體保護效果最佳，菌體細胞存活率分別為43.85%、47.51%和40.86%。3種保護劑對菌體保護效果之間無顯著性差異（P＞0.05）。而其他6種保護劑對菌體保護效果次之（P＜0.05）。

2.3 正交試驗

為了使菌體細胞在冷凍干燥過程中達到最大存活率，僅使用單一的保護劑難以達到預期的保護效果，采用復配保護劑可以在冷凍過程中各自發揮作用，又能發揮協同作用，對菌體的保護效果較理想，為確定最優的保護劑配方，對海藻糖、甘油、脫脂乳和谷氨酸鈉進行用量正交試驗，得到用量正交試驗結果見表3。

表3 凍干保護劑配方優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for cryoprotectants formula optimization

由表3可知，海藻糖、谷氨酸鈉、甘油和脫脂乳4種凍干保護劑的極差分別為10.23、22.18、17.91、12.47，說明4種保護劑對細菌凍干前后存活率的影響大小依次為谷氨酸鈉＞甘油＞海藻糖＞脫脂乳。根據凍干后的菌體細胞存活率可得，最佳保護劑配方為海藻糖60 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、甘油20 g/L、脫脂乳150 g/L。在此最佳條件下，菌體細胞存活率可達88.41%。

海藻糖由于具有多個羥基，能與菌體表面的自由基結合，避免菌體暴露在介質中，同時可與蛋白質形成氫鍵取代水，維持蛋白質的穩定性[18]；脫脂奶粉主要是在菌體表面形成保護層[19]；甘油和谷氨酸鈉能滲透到細胞內部，使結合水的能力更強，抑制過度失水，防止細胞在冷凍過程中冰晶的形成[19]。而不同菌種最適的保護劑是不同的，復合保護劑體系中每種成分在冷凍干燥過程中都發揮各自的作用，所以，相比于單一的保護劑，以一定比例復配的保護劑效果更好。

2.4 掃描電鏡驗證最優保護劑配方

為確定最優保護劑配方的保護效果，嗜熱鏈球菌M5-5添加保護劑凍干前后菌體的形態進行觀察，結果見圖2。

圖2 凍干保護劑對細菌細胞形態的影響Fig.2 Effect of cryoprotectants on bacterial cell morphology

由圖2可知，未加保護劑組的菌體細胞相互黏連，細胞不完整，可能是由于細胞膜破壞造成的，加入復配保護劑后，菌體細胞完整性較好，表面光滑，結果表明，添加保護劑能有效地保證在凍干過程中細胞膜仍保持滲透系統和細胞膜的完整性，避免細胞內容物的流出而導致細胞死亡[20]。

3 結論

本試驗研究了不同凍干保護劑對嗜熱鏈球菌M5-5的存活率和形態的影響。結果表明：相比于其他6種保護劑，海藻糖、甘油和脫脂乳對菌體的保護效果更顯著，凍干后菌體存活率分別為43.85%、47.51%和40.86%。正交試驗結果表明，凍干保護劑的最佳配方為海藻糖60 g/L、谷氨酸鈉20g/L、甘油20g/L、脫脂乳150g/L，此時嗜熱鏈球菌M5-5凍干后菌體存活率可達88.41%。掃描電鏡觀察結果顯示，優化后的復合保護劑配方對嗜熱鏈球菌M5-5的菌體形態和生物膜均有良好的保護作用。

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Optimization of cryoprotectant formula forStreptococcus thermophilusM5-5 during freeze-drying

JIAO Lin1,ZHENG Xiaowei2,QU Xiaoyu1,SHEN Tong1,YANG Jie1*
(1.College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.Biotechnology Center,Nutrition and Health Institute,COFCO,Beijing 102209,China)

In order to investigate the effect of different cryoprotectants on cell viability ofStreptococcus thermophilusM5-5 in the process of vacuum freeze-drying,single-factor experiments combining with orthogonal experiments were carried out to optimize protective agents formula based on the cell survival rate ofS.thermophilusM5-5 after vacuum freeze-drying.Results showed that the cell survival rate ofS.thermophilusM5-5 using trehalose,glycerol and skim milk as protective agents was 43.85%,47.51%,and 40.86%,respectively,higher than that using other six protective agents. The optimum protective agents formula forS.thermophilusM5-5 were determined as follows:trehalose 60 g/L,sodium glutamate 20 g/L,glycerol 20 g/L,skim milk 150 g/L,and the cell survival rate ofS.thermophilusM5-5 after vacuum freeze-drying reached 88.41%.Scanning electron microscope results showed that the cell with cryoprotectant addition was intact with smooth surface,which indicated that the well-performed cryoprotectant could effectively reduce the damage on bacterial cells during vacuum freeze-drying.

Streptococcus thermophilus;cryoprotectant;scanning electron microscope

TS202.3

0254-5071（2017）03-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.020

2016-12-05

新疆維吾爾自治區科技興新項目（2010037B26）

焦琳（1992-），女，碩士研究生，研究方向為乳酸菌發酵劑。

*通訊作者：楊潔（1963-），女，教授，博士，研究方向為功能性食品。月后的存活率與凍干后直接測得的存活率分別是71.3%和72.4%，表現出較好的貯藏穩定性[13]。

乳酸菌是公認的益生菌，在維護人和動物腸道健康、促進體內微生物生態平衡方面起著重要作用。乳酸菌在發酵過程中產生的各種代謝產物能有效改善腸胃功能、增加免疫力、清除自由基。因此，乳酸菌的潛在應用價值使其成為研究的熱點[1]。但乳酸菌本身對外界環境的耐受能力差，很難在生產加工和運輸過程中保持高活性，從而影響其本身的發酵性能[2]，因此保持乳酸菌在生產流通過程中的高活性至關重要，也是未來發酵領域的發展方向[3]。

目前，真空冷凍干燥是有效保存菌種的方法之一[4]。然而在冷凍過程中，細胞內水形成冰晶，會改變細胞內的pH值和離子強度，增加細胞膜的通透性，對細胞造成嚴重損傷；而且真空干燥過程會加速樣品表面水分流失，破壞生物大分子的水保護層，降低細胞生物活性[5]。因此，為了盡可能減小冷凍干燥過程對細胞的損傷，降低乳酸菌的死亡率，延長菌種保藏期[6-8]，選擇合適的保護劑至關重要。

冷凍保護劑分為非滲透性和滲透性兩種。非滲透性保護劑可以在細胞表面形成保護層，而滲透性保護劑則能進入細胞內部與水分子結合，減緩冰晶形成，且減少細胞在干燥過程中的水分流失[9-10]。HUB?LEK Z[11]研究發現，將非滲透性和滲透性保護劑進行復配可以更有效維持細胞在冷凍干燥過程中的生物活性。LIM C M等[12]研究發現，在冷凍干燥過程中添加脫脂乳和蔗糖后，Lactobacillus salivariusI 24的存活率可達13%和9%；添加2.5%的谷氨酸鈉作為保護劑凍干酒類酒球菌（Oenococcusoeni），貯藏6個