枯草芽孢桿菌精氨酸脫羧酶基因speA的表達(dá)與蛋白純化

曹寧，王亞娟，鐘杰，佟碩秋，吳擁軍*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

枯草芽孢桿菌精氨酸脫羧酶基因speA的表達(dá)與蛋白純化

曹寧，王亞娟，鐘杰，佟碩秋，吳擁軍*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

根據(jù)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2的精氨酸脫羧酶（ADC）的編碼基因speA序列設(shè)計(jì)特異性酶切引物，克隆基因speA序列。測(cè)序結(jié)果顯示，基因speA全長(zhǎng)為1 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為58 ku。基因speA克隆至原核表達(dá)載體，獲得重組菌pET28a-speA/BL21，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，1.0 mmol/L的異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）28℃誘導(dǎo)4 h，上清液和菌體均能表達(dá)出ADC蛋白，上清液經(jīng)純化、透析、冷凍干燥可獲得純度97%的ADC酶，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）ADC酶活為16 780 U/mg。為speA基因的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌；精氨酸脫羧酶；表達(dá)；純化

生物胺（biogenic amine，BA）是一類具有生物活性、低分子質(zhì)量、含氮有機(jī)化合物的總稱。根據(jù)組成成分可分為單胺（酪胺、組胺、尸胺、苯乙胺、色胺等）和多胺（腐胺、精胺和亞精胺）兩大類[1]。生物胺可作為生物體合成荷爾蒙、核苷酸、蛋白質(zhì)的前體物質(zhì)，具有一定生理功能。但是過(guò)量攝入，則會(huì)引起諸如頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)危及生命[2]。

生物胺的產(chǎn)生需具備游離的氨基酸和氨基酸脫羧酶，通過(guò)氨基酸脫羧酶催化使氨基酸脫羧而產(chǎn)生[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸脫羧酶主要存在于芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、埃希氏桿菌屬、變性菌屬、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬及一些檸檬酸細(xì)菌屬細(xì)菌，其中乳酸桿菌的催化脫羧作用最為突出[4]。

貴州地區(qū)水豆豉屬于典型的多菌混合細(xì)菌型自然發(fā)酵豆豉，主要參與發(fā)酵的微生物有芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、腸球菌屬、叢毛單胞菌屬、乳酸菌屬和微球菌屬等，在這些微生物的發(fā)酵作用下形成風(fēng)味獨(dú)特的豆豉[5]。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌型豆豉能夠有效分離出8種生物胺，分別是色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。其中前發(fā)酵階段亞精胺含量最高，精胺次之，后發(fā)酵階段酪胺含量最高，且顯著高于其他生物胺2倍以上[6]。在枯草芽孢桿菌中生物胺合成只有一條途徑，起始于精氨酸，在精氨酸脫羧酶、胍基丁胺酶、亞精胺合酶和精胺合酶共同作用合成亞精胺或精胺[7-8]。精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）作為胺合成的關(guān)鍵酶[9-10]對(duì)精胺和亞精胺的形成起著重要的作用。所以目前認(rèn)為控制食品中過(guò)量生物胺最有前景的方法是通過(guò)控制精氨酸脫羧酶的活性來(lái)控制生物胺的形成[7]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是中國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的一種重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌，現(xiàn)已大量用于食品發(fā)酵行業(yè)[11]。本實(shí)驗(yàn)室從水豆豉樣品中分離獲得了B.subtilis BJ3-2菌株[12]。本研究對(duì)B.subtilisBJ3-2菌株中獲得的精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase ADC）基因speA序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，通過(guò)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2、大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α：本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；表達(dá)載體pET28a、宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：德國(guó)默克（中國(guó)）公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基：配制方法參考文獻(xiàn)[13]。

T4 DNA連接酶、溶菌酶、基因組DNA提取試劑盒：美國(guó)Promega公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）、DL2000 DNA Marker、rTaqDNA聚合酶、蛋白質(zhì)Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.1連接試劑盒：TaKaRa（大連）公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、卡拉霉素（kanamycin，Kan）：北京索萊寶科技有限公司；E.Z.N.A.TMGelExtraction Kit、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini KitⅠ：美國(guó)Omega公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、精氨酸脫羧酶（ADC）酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海生工生物工程有限公司；His.Bind Purification Kit試劑盒：美國(guó)Novagen公司；咪唑（純度99%）：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-161高速臺(tái)式離心機(jī)、MyCycler PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；Biosafer-10D真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Thermo公司。SW-CJ-1FD標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋：英國(guó)阿斯太歐（Astell）公司；SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司；DYCZ-25D小型垂直電泳槽（SDA-PAGE電泳槽）、DYY-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取

挑選B.subtilisBJ3-2的單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按照Promega公司的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取B.subtilis BJ3-2全基因組。

1.3.2 PCR擴(kuò)增精氨酸脫羧酶基因

根據(jù)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2的speA基因序列，設(shè)計(jì)合成含BamHI引物PF：CGCGGATCCATGTCTCA ACATGAAACACCC和含XhoI引物PR：CCGCTCGAGTT GAATTGCTTTTTGTTCTTTG。采用PCR擴(kuò)增引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：10μmol/μLPF和PR各0.4 μL、10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMixture1.6μL、模板DNA1μL、rTaqDNA聚合酶0.1μL、ddH2O14.5μL，總體積20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 重組質(zhì)粒pGEM-T-speA的構(gòu)建及測(cè)序

PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T連接，連接的過(guò)程及產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化過(guò)程按試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將連接好的10 μL產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽(yáng)性重組子，提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定。將陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒后送至Life Technologies公司進(jìn)行測(cè)序[14]。序列結(jié)果通過(guò)網(wǎng)站http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的BLAST軟件對(duì)基因序列進(jìn)行在線的比對(duì)和分析，鑒定所克隆的基因是否為目的基因。將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGEM-T-speA。

1.3.4 重組質(zhì)粒pET28a-speA的構(gòu)建

將質(zhì)粒pGEM-T-speA和表達(dá)載體pET28a分別用BamH I（37℃）和XhoI（37℃）雙酶切，對(duì)目的片段膠回收并純化，用T4 DNA連接酶將雙酶切產(chǎn)物和載體pET28a連接。按照試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2.1中的說(shuō)明書(shū)的使用方法進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3）中，劃線接種到含有Kan的LB固體平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，同時(shí)接種到含有Kan（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒DNA后進(jìn)行酶切鑒定。

1.3.5 重組蛋白精氨酸脫羧酶的表達(dá)

將重組菌pET28a-speA/BL21和pET28a/BL21分別接種于5 mL含Kan（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm=0.4～0.6，用終濃度為1 mmol/L的IPTG，28℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取1 mL菌液4 000 r/min離心收集菌體，加入500μL的pH7.4磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）溶液重懸后進(jìn)行超聲波破碎（破碎條件：冰浴、200 MHz、超聲3 s，間隔2 s）30 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液即為重組蛋白精氨酸脫羧酶。分別取20 μL上清液和超聲沉淀上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)（分離膠濃度為15%濃縮膠濃度為5%），考馬斯亮藍(lán)R-250染色、脫色[11]，凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行灰度掃描分析。

1.3.6 重組蛋白的純化及濃度測(cè)定

參照His.Bind Purification Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)重組蛋白精氨酸脫羧酶進(jìn)行純化，純化條件：依次采用濃度為10 mmol/L、50 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L的咪唑溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行透析除鹽，將透析過(guò)后的蛋白質(zhì)樣品裝入無(wú)菌離心管內(nèi)，立即置于液氮中2 min，將其快速?gòu)氐變鐾福D(zhuǎn)入大氣壓為110 kPa的冷凍干燥機(jī)，4℃預(yù)冷15～30 min，放入樣品，啟動(dòng)真空泵，37℃干燥24～72 h，取出樣品即為純化后的重組蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度[15]。

1.3.7 重組蛋白酶活的測(cè)定

參照ADC酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)重組蛋白精氨酸脫羧酶活性進(jìn)行測(cè)定。以精氨酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)試劑的酶活力作為橫坐標(biāo)，吸光度值OD450nm作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品所測(cè)得的OD450nm代入酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程式，算出樣品酶活力后乘以稀釋倍數(shù)所得值即為樣品實(shí)際酶活力大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilisBJ3-2基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增

以菌株B.subtilisBJ3-2基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增speA基因，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，泳道1～4出現(xiàn)約1條帶，其中約1 400 bp處擴(kuò)增帶與預(yù)期的speA大小相符。

圖1 speA基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of genespeAby PCR amplification

2.2 重組質(zhì)粒PCR的鑒定

圖2 重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2Electrophoretogramof recombinant plasmid by PCR amplification

目的DNA片段進(jìn)行膠回收，連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α。經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的重組菌落接種到LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，結(jié)果（圖2）可知，在預(yù)期的1 400 bp處出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)正確克隆至pGEM-T載體，重組載體命名為pGEM-speA。

2.3 目的基因的序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，B.subtilisBJ3-2精氨酸脫羧酶基因speA大小為1 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，計(jì)算其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53.53 ku，等電點(diǎn)為5.29，酸性氨基酸19.6%，堿性氨基酸12.2%。與GenBank中登錄號(hào)為KJ561348序列完全一致，說(shuō)明所克隆的基因正確。

2.4 重組表達(dá)載體pET28a-speA構(gòu)建及鑒定

以BamH I和XhoI分別雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒pGEM-T-speA與pET28a載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抗性篩后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖3。取1號(hào)菌過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 pET28a-speA重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of recombinant plasmid pET28a-speA by PCR amplification

由圖3可知，挑取得3個(gè)菌落均擴(kuò)增出均出現(xiàn)1條帶，其中約1400bp處擴(kuò)增帶與預(yù)期的speA大小相符，說(shuō)明目的基因已正確克隆至pET28a載體中，重組質(zhì)粒命名為pET28a-speA。

圖4 pET28a-speA重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET28a-speA

由圖4可知，酶切產(chǎn)物片段大小與克隆的基因大小相符。泳道2、3均酶切出兩個(gè)條帶，其中較小的條帶出現(xiàn)的位置大約在1 400 bp處，與目的基因（speA）序列大小一致。其中泳道3目的片段稍微偏大，可能由于瓊脂糖凝膠制備原因所致。為確定讀碼框是否正確，取2號(hào)泳道菌進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示序列長(zhǎng)度為1473bp，同時(shí)在pET28a載體中的讀碼框也正確，這表明克隆的精氨酸脫羧酶基因與表達(dá)載體pET28a連接成功，即預(yù)期獲得重組表達(dá)載體pET28a-speA重組子。

2.5 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將pET28a-speA/BL21（DE3）重組菌接種于含Kan（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基，28℃搖瓶大量培養(yǎng)，1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后離心，分別取上清、沉淀及未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，未添加誘導(dǎo)物的菌液蛋白基本不表達(dá)，泳道2、3和4號(hào)均出現(xiàn)顯著的蛋白條帶，說(shuō)明ADC蛋白在上清、菌體內(nèi)都能表達(dá)。通過(guò)軟件Quantity One分析得出目的蛋白的分子大小約為58 ku，與推測(cè)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小相當(dāng)。誘導(dǎo)表達(dá)的ADC蛋白菌體為包涵體形式表達(dá)，上清為可溶性表達(dá)且表達(dá)量更高，因此選取可溶性部分進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of protein inducible expression by SDS-PAGE analysis

2.6 蛋白的純化

對(duì)pET28a-speA/BL21（DE3）重組菌進(jìn)行500 mL大量表達(dá)，取上清利用His純化試劑盒進(jìn)行過(guò)柱純化，純化后大部分雜蛋白被除去，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，純化結(jié)果表明，10～500 mmol/L咪唑洗脫均能獲得目的蛋白，其中200 mmol/L咪唑可洗脫獲得較高濃度的蛋白帶。選擇該濃度進(jìn)行剩余蛋白的洗脫，合并所有洗脫液進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步純化處理。

圖6 純化蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of purified protein by SDS-PAGE analysis

2.7 蛋白含量的測(cè)定

采用方法測(cè)定純化后重組蛋白含量，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值OD595nm（Y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程為：Y=3.515 4X+0.002，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 4，按照回歸方程計(jì)算ADC蛋白質(zhì)含量為0.97 mg/mL，即純度為97%。

2.8 ADC酶活的檢測(cè)

選用酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)重組蛋白ADC酶活進(jìn)行檢測(cè)，以精氨酸脫羧酶標(biāo)準(zhǔn)試劑的酶活（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值OD450nm（Y）為縱坐標(biāo)，繪制ADC酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程為：Y=0.008 1X+0.036 4，R2=0.980 2，根據(jù)回歸方程計(jì)算ADC酶活為16 780 U/mg。

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌作為豆豉發(fā)酵過(guò)程中的主要菌種，本研究成功克隆獲得了B.subtilisBJ3-2精氨酸脫羧酶基因speA。以pET-28a作為表達(dá)載體，經(jīng)IPGT誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析，在200mmol/L咪唑處可洗脫獲得較高濃度蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)其濃度為0.972mg/mL，即純度為97%。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)精氨酸脫羧酶酶活為16 780 U/mg。通過(guò)對(duì)主效微生物枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的主要生物胺相關(guān)酶—ADC進(jìn)行表達(dá)純化以及酶活性研究，可以進(jìn)一步探索酶活性與生物胺的關(guān)聯(lián)性，以ADC活性作為指標(biāo)可以反映出發(fā)酵豆豉的品質(zhì)；同時(shí)通過(guò)對(duì)酶活性影響因素的研究，進(jìn)而達(dá)到控制發(fā)酵過(guò)程，從而降低生物胺提高發(fā)酵食品安全性的目的。

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Expression and purification of arginine decarboxylase genespeAofBacillus subtilis

CAO Ning,WANG Yajuan,ZHONG Jie,TONG Shuoqiu,WU Yongjun*
(College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Specific enzyme primers were designed according to the arginine decarboxylase(ADC)gene sequence ofBacillus subtilisBJ3-2,the gene speAwas cloned and obtained.The results of sequence analysis indicated that the full-length of genespeAwas 1 473 bp,which could encode 490 amino acids with deduced molecular mass of 58 ku.The genespeAwas cloned into prokaryotic expression vector to obtain recombinant strain pET28a-speA/BL21.The results of SDS-PAGE showed that the target protein was induced with 1.0 mmol/LIPTG at 28℃for 4 h,and the ADC protein could be expressed in supernatant fluid and bacteria.After purification,dialysis and freeze-drying,the ADC with 97%purity was obtained in supernatant fluid.The ADC activity was 16 780 U/mg by ELISA.The study laid a theoretical foundation for expression,purification and enzymatic properties of genespeA.

Bacillus subtilis;arginine decarboxylase;expression;purification

Q936

0254-5071（2017）03-0090-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.019

2016-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260394/C200207）

曹寧（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

*通訊作者：吳擁軍（1971-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）進(jìn)行表達(dá)，獲得精氨酸脫羧酶，并對(duì)其進(jìn)行純化和酶活力的檢測(cè)對(duì)其ADC基因的研究會(huì)有助于進(jìn)一步了解多胺的合成途徑，可用于后期酶學(xué)性質(zhì)的研究，以期為實(shí)際生產(chǎn)中抑制ADC活性、間接控制腐胺、亞精胺和精胺等相關(guān)生物胺的合成提供理論依據(jù)。