不同菌種發酵對豆豉游離脂肪酸構成的影響

謝艷華，陳力力，2，謝靚，李夢丹，李跑，陳淼芬，蔣立文，2*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.食品科技和生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；3.獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南長沙410128）

不同菌種發酵對豆豉游離脂肪酸構成的影響

謝艷華1，陳力力1，2，謝靚1，李夢丹1，李跑1，陳淼芬3，蔣立文1，2*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.食品科技和生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；3.獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南長沙410128）

熟化黃豆分別接種毛霉（總狀毛霉）、細菌（納豆芽孢桿菌）和曲霉（米曲霉），經不同發酵工藝形成三種不同類型的豆豉，研究三種不同菌種接種發酵處理對豆豉中游離脂肪酸構成的影響。結果表明熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉、曲霉型豆豉分別鑒定出9種、11種、9種、8種游離脂肪酸；四種樣品中游離脂肪酸含量從高到低依次是毛霉型豆豉（3736.3mg/100g）＞熟化黃豆（1911.16mg/100g）＞細菌型豆豉（1 421.02 mg/100 g）＞曲霉型豆豉（924.55 mg/100 g），多不飽和脂肪酸含量分別為毛霉型豆豉（2 087.51 mg/100 g）＞熟化黃豆（1 065.53 mg/100 g）＞細菌型豆豉（731.17 mg/100 g）＞曲霉型豆豉（478.64 mg/100 g）。研究結果表明，經不同菌種發酵的豆豉游離脂肪酸組成和含量有差異。

豆豉；總狀毛霉；納豆芽孢桿菌；米曲霉；游離脂肪酸

本試驗擬在黃豆發酵過程中，將總狀毛霉（Mucor racemosus）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、米曲霉（Aspergillus oryzae）三者作為發酵劑分別接種其中，通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法進行分析、鑒定，通過與脂肪酸標準品對比，分析比較其中的游離脂肪酸組成和含量情況，探討豆豉發酵加工過程中3種菌株對游離脂肪酸變化所起的作用，以期為合理有效地利用、開發及推廣發酵豆制品提供可靠數據，為傳統發酵大豆制品升級提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：購于湖南農業大學東之源超市；總狀毛霉（Mucor racemosus）CGMCC8700、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）：本教研室從納豆中分離并純化；米曲霉（Aspergillusoryzae）AS3.042：湖南農業大學食品科技學院提供。

甲醇溶液、正己烷（均為色譜純）、無水硫酸鈉、KOH、H2SO4、氯仿、異丙醇、乙酸、乙醚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；37種脂肪酸甲酯混標：美國西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT氣相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司；ML204/02精密天平：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；XW-80A漩渦混合器：上海青浦滬西儀器廠；2323K冷凍離心機：德國HERMLE公司；FW100高速萬能粉碎機：天津市太斯特儀器有限公司；SAX/PSA氨丙基固相萃取柱（6 mL，500 mg）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸標準曲線的制作

先將37種脂肪酸甲酯混標配制成標準儲備液和標準工作液。

37種脂肪酸甲酯混標儲備液：將質量濃度為10 g/L的37種脂肪酸甲酯混標1 mL移至10 mL容量瓶中，并用正己烷定容。-20℃條件下避光保存。

標準工作液：吸取2.5 mL37種脂肪酸甲酯混標儲備液于5 mL容量瓶中，并用正己烷定容，制成0.500 0 g/L的標準工作液，再從中吸取2.5 mL于新的5 mL容量瓶中，正己烷定容，制成0.250 0 g/L的標準工作液，以此類推，逐級稀釋，分別制成0.500 0 g/L、0.250 0 g/L、0.050 0 g/L、0.025 0 g/L、0.0100g/L、0.0050g/L的標準工作液以供GC-MS檢測使用。

使用預先配制好的37種脂肪酸甲酯混標儲備液和標準工作液1.000 0 g/L、0.500 0 g/L、0.250 0 g/L、0.125 00 g/L、0.100 0 g/L、0.050 0 g/L在給定GC-MS條件下進樣，進樣量l μL，每個濃度的工作液重復進樣3次。以脂肪酸甲酯質量濃度（x）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 純種毛霉型豆豉、細菌型豆豉、曲霉型豆豉的制作

純種毛霉型豆豉的制作：黃豆精選去雜→浸泡→水洗→熟化（121℃、20 min）→冷卻→接種擴大培養的毛霉菌→前發酵（25℃、48～72 h）→厭氧后發酵（8%食鹽、0.5%蒸餾酒、1%生姜，發酵時間30 d以上）→成熟。

純種細菌型豆豉的制作：黃豆精選去雜→浸泡約12 h使體積增加至2倍左右→熟化（121℃、20 min）→冷卻→接種擴大培養的納豆芽孢桿菌液→40℃發酵24h→冷藏48h。

純種曲霉型豆豉的制作：黃豆精選去雜→浸泡（夏季4～6 h）→熟化（121℃、20 min）→攤涼→冷卻→接種曲霉菌→制曲（30～35℃、48～72 h）→拌料（8%食鹽、2%白酒和1%的甜酒）→裝壇→厭氧保溫后酵3個月以上。

1.3.3 熟化黃豆、毛霉型、細菌型和曲霉型豆豉粗脂肪提取[12]

稱取熟化黃豆、毛霉型豆豉、成熟細菌型豆豉和曲霉型豆豉各60 g，置于80℃烘箱中干燥至恒質量，研磨粉碎后過40目篩得到干粉。將準確稱取的0.12 g干黃豆粉和干豆豉粉置于15 mL試管中，加入正己烷6 mL。超聲波功率350 W，溫度40℃，提取時間為30 min。

1.3.4 熟化黃豆、毛霉型、細菌型和曲霉型豆豉游離脂肪酸

的分離[13]

稱取熟化黃豆、成熟毛霉型豆豉、細菌型豆豉和曲霉型豆豉干粉0.36 g，用1 mL氯仿溶解，然后經氨丙基硅膠固相萃取柱吸附，用3 mL氯仿異丙醇（2∶1，V/V）洗脫中性脂肪，用3 mL的2%乙酸-乙醚溶液洗脫游離脂肪酸，將樣品溶劑用氮氣吹干。

1.3.5 熟化黃豆、毛霉型、細菌型和曲霉型豆豉游離脂肪酸

甲酯化

在已提取游離脂肪酸的15 mL試管中，加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液3 mL，60℃水浴酯化15 min，冷卻至室溫，加入體積分數5%硫酸-甲醇溶液3 mL，60℃水浴酯化15min，冷卻后加入少許無水硫酸鈉，4000r/min離心2min。靜置分層，吸取上清液于干燥潔凈試管中，使用漩渦混合器使其混合均勻，通過0.22μm的濾膜過濾后注入干燥好的潔凈樣品瓶中。

1.3.6 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：色譜柱：CD-WAX石英毛細管柱（30m× 0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱溫45℃，保持1 min，以5℃/min速率升溫至290℃，最后保持2 min。載氣：高純氦氣（99.999%）；流速1.0 mL/min；進樣口溫度為250℃；不分流進樣；進樣量1 μL。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度200℃；發射電流150μA；倍增器電壓1037V；萃取頭接口溫度220℃；電子能量70eV；質量掃描范圍45～500m/z。

1.3.7 定性定量方法

樣品均進行3次重復，將檢測結果進行定性和定量分析，采用SAS、Origin7.5等軟件進行數據分析，比較不同方法之間的差異性。

定性分析：將檢測信息用美國國家標準技術研究所（nationalinstitute ofstandardsandtechnology，NIST）14s.LIB譜庫檢索，查詢文獻資料，對熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉和曲霉型豆豉中各脂肪酸甲酯進行核對和確認（相似度值≥90%，百分含量≥0.1%）。

定量分析：采用峰面積歸一化法計算各種成分的相對含量，外標法計算各種成分的絕對含量。

2 結果與分析

2.1 目標物的標準曲線及其相關系數

按1.3.6中的色譜條件，經過GC-MS分析得到37種脂肪酸甲酯混標總離子流色譜圖見圖1。根據各相關色譜峰的離子質量，并檢索NIST14s.LIB譜庫，確定其脂肪酸的種類。預實驗顯示，4種樣品中含有的脂肪酸大致有11種，其主要脂肪酸分別為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。由圖1可知，脂肪酸甲酯總離子流圖基線穩定且離子峰基本分離。

圖1 脂肪酸甲酯混合標準品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of fatty acid methyl ester mixed standards

根據不同質量濃度37種脂肪酸甲酯混合標準品的總離子流色譜圖，以標準品質量濃度（x）為橫坐標，相對應的標準品峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，結果見表1。

表1 主要脂肪酸甲酯線性關系實驗結果Table 1 Linear regression equations,linear ranges and detection limits of main fatty acid methyl esters

由表1可知，各標準曲線回歸方程相關系數R2均＞0.9990，說明在測定質量濃度范圍內，幾種脂肪酸甲酯線性關系良好，適合于4種大豆及豆豉相關脂肪酸的定量分析。

2.2 熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉及曲霉型豆豉游離脂肪酸的定量分析及不同發酵劑對豆豉游離脂肪酸種類、含量的影響

熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉及曲霉型豆豉中游離脂肪酸的GC-MS總離子流圖見圖2。

圖2 熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉及曲霉型豆豉游離脂肪酸的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of free fatty acid in cooked soybean, Mucor-type Douchi,bacterial-type Douchi andAspergillustype Douchi by GC-MS

根據NIST 14s.LIB質譜數據庫和人工譜圖解析相結合的手段將色譜圖經行比對，對總離子流圖中各組分進行峰面積歸一化，結合脂肪酸甲酯標準曲線得出的熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉以及曲霉型豆豉中游離脂肪酸種類及含量（以干基計）（表2）。熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉、曲霉型豆豉分別含有9種、11種、9種、8種游離脂肪酸，與毛霉型豆豉相比，原料黃豆和細菌型豆豉均未檢測到肉豆蔻酸和（Z）-十六烯酸兩種游離脂肪酸，而曲霉型豆豉除了未檢測到上述兩種游離脂肪酸，順式-11-二十碳烯酸也未檢測到。微生物具有分解脂質的作用，熟化黃豆接種毛霉后，黃豆中的油脂在毛霉和酯酶的作用下，分解得到各種游離脂肪酸，包括肉豆蔻酸和（Z）-十六烯酸。曲霉型豆豉與原料黃豆相比，不含有順式-11-二十碳烯酸，是由于在氧氣充足的條件下不飽和脂肪酸發生氧化作用[14]。

從脂肪酸的飽和程度分析，由表2可知，熟化黃豆、細菌型豆豉和曲霉型豆豉均含有5種飽和游離脂肪酸，毛霉型豆豉含有6種飽和游離脂肪酸；熟化黃豆和細菌型豆豉均含有2種單不飽和游離脂肪酸，而毛霉型豆豉含有3種單不飽和游離脂肪酸，曲霉型豆豉僅1種單不飽和游離脂肪酸；四種樣品中均含有2種多不飽和游離脂肪酸。四者的游離脂肪酸飽和程度比例和種類基本類似。

表2 熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉、曲霉型豆豉中游離脂肪酸的鑒定結果Table 2 Identification results of free fatty acids in cooked soybean,Mucor-type Douchi,bacterial-type Douchi andAspergillus-type Douchi

熟化黃豆和豆豉中含有幾種C13～C22的飽和游離脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸等。傳統的觀點認為飽和脂肪酸是一類“壞”的脂肪酸，早期研究[15]發現，富含飽和脂肪酸的膳食會使血清總膽固醇升高，尤其是低密度脂蛋白膽固醇的水平，增加患心血管疾病的風險。但最近有研究[16]表明飽和脂肪酸攝入不足也會對人體造成影響。另外，還有研究發現硬脂酸能作為ω-3多不飽和脂肪酸的補充來源[17]。因此，對于黃豆及豆豉的喜愛者不必有過多的擔憂。

單不飽和脂肪酸（mono-unsaturatedfattyacids，MUFA）作為膳食脂肪酸中的一類，具有特殊的生理功能和獨特的物理、化學特性，在日常飲食中也與人們接觸密切。單不飽和脂肪酸最具代表性的是油酸，四種樣品中油酸含量均較高，毛霉型豆豉中油酸含量高達652.24 mg/100 g。多年來，對單不飽和脂肪酸的生理與保健作用存在分歧，但近年來的研究普遍認為順式單不飽和脂肪酸對膽固醇和血糖有明顯降低的作用[18-20]，即油酸有降低膽固醇和血糖的作用，在四種樣品中毛霉型豆豉的油酸含量最高，降膽固醇和血糖的效果可能更顯著。

目前認為營養上最具價值的兩類脂肪酸是n-6系列和n-3系列多不飽和脂肪酸（poly-unsaturated fatty acids，PUFA），主要包括亞油酸和亞麻酸。四種樣品中含有較高的多不飽和脂肪酸，含量最低曲霉型豆豉也有478.64 mg/100 g，毛霉型豆豉中多不飽和脂肪酸含量高達2087.51mg/100g。亞油酸有助于生長、發育及妊娠，特別是皮膚和腎的完整性只依賴n-6系列多不飽和脂肪酸，其中亞油酸最為有效[21]。亞麻酸在體內代謝可生成二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），同時具備多不飽和脂肪酸的多種生理功能，突出表現在降血脂和對心血管疾病的防治上[22]。對于需要攝入較多多不飽和脂肪酸的人群，適當地多食用黃豆及其制品特別是毛霉型豆豉是比較適宜的。

毛霉型豆豉的飽和游離脂肪酸含量是熟化黃豆的1.90倍，不飽和游離脂肪酸是熟化黃豆的1.98倍，油酸、亞油酸、亞麻酸分別是熟化黃豆的2.02、1.94、2.05倍；熟化黃豆的飽和游離脂肪酸含量是細菌型豆豉的1.24倍，不飽和游離脂肪酸是細菌型豆豉的1.39倍；而熟化黃豆的飽和游離脂肪酸含量是曲霉型豆豉的1.70倍，不飽和游離脂肪酸是細菌型豆豉的2.25倍。毛霉型豆豉中游離脂肪酸遠高于熟化黃豆中游離脂肪酸的原因有以下幾個：一方面熟化黃豆在酯酶的作用下油脂水解產生大量游離脂肪酸，毛霉能夠產生脂肪酶，將其中的脂肪分解成甘油和游離脂肪酸[23]，使豆豉產生芳香物質，同時改善豆豉風味和促進豆豉成熟[24]。另一方面毛霉型豆豉后發酵階段是一個厭氧發酵階段，且食鹽、白酒等的添加使大部分微生物生長受到抑制，在氧氣含量較低的情況下，脂肪酸自動氧化速率大大降低。而熟化黃豆接種納豆芽孢桿菌和米曲霉后游離脂肪酸含量有所降低的原因可能是以下幾個：第一，游離脂肪酸的自動氧化的速度高于油脂水解的速度；第二，在酶的作用下，飽和游離脂肪酸發生β-氧化作用而形成酮酸和甲基酮；第三，發酵過程中微生物的生長需要能量，消耗了大量的碳水化合物之后，需要消耗脂肪酸作為能量補充。分解脂肪酸的酶系可以分解豆豉中的游離脂肪酸，使之成為酯類等，從而賦予產品特有的香味。第四，在曲霉菌存在的條件下，飽和游離脂肪酸發生酶促氧化[25]。有研究發現丹貝（根霉型豆豉）中不飽和脂肪酸含量是原料黃豆的5.52倍，納豆（細菌型豆豉）的7.15倍[11]。表明不同微生物和不同加工工藝對脂肪酸有影響，具體原因有待進一步探究。

3 結論

本研究采用正己烷提取熟化黃豆和豆豉中的脂肪酸，通過固相萃取柱分離出游離脂肪酸，經甲酯化處理，用氣相色譜-質譜聯用儀分析，熟化黃豆、毛霉型豆豉、細菌型豆豉、曲霉型豆豉分別鑒定出9種、11種、9種、8種游離脂肪酸，其主要脂肪酸均為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸。通過與脂肪酸標準品進行對照，對樣品中的游離脂肪酸進行定量分析，其中毛霉型豆豉中不飽和脂肪酸含量最高，達2 757.19 mg/100 g，分別是黃豆、細菌型豆豉、曲霉型豆豉的1.98、2.75、4.44倍。樣品中還含有其他種類的含量較少的脂肪酸如：毛霉型豆豉中含有肉豆蔻酸7.60 mg/100 g等。研究表明，不同發酵工藝和發酵劑使豆豉中游離脂肪酸在組成及含量上均存在一定的差異。本研究可助力將不同發酵豆制品開發成不同功能性保健食品，同時為豆豉中脂肪酸指紋圖譜的建立提供數據積累和研究依據。

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Effect of starter cultures on free fatty acid composition of Douchi

XIE Yanhua1,CHEN Lili1,2,XIE Jing1,LI Mengdan1,LI Pao1,CHEN Miaofen3,JIANG Liwen1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China;3.National and Provincial Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative,College of Food Science and Technology,Changsha 410128,China)

Mucor racemosus,Bacillus nattoandAspergillus oryzaewere separately inoculated into cooked soybeans.Three different types of Douchi were prepared with different fermentation processes.The effect of these three strains on free fatty acids composition in Douchi was investigated.The results showed that there were 9,11,9,and 8 kinds of free fatty acids identified in cooked soybean,Mucor-type Douchi,bacterial-type Douchi and Aspergillus-type Douchi,respectively.The total free fatty acids contents in four samples in order wasMucor-type Douchi(3 736.3 mg/100 g),cooked soybean(1 911.16 mg/100 g),bacterial-type Douchi(1 421.02 mg/100 g),Aspergillus-type Douchi(924.55 mg/100 g).The polyunsaturated fatty acids contents in four samples in order wereMucor-type Douchi(2 087.51 mg/100 g),cooked soybean(1 065.53 mg/100 g),bacterial-type Douchi (731.17 mg/100 g)andAspergillus-type Douchi(478.64 mg/100 g).The results showed that the composition and contents of free fatty acids in different fermented Douchi were different.

Douchi;Mucor racemosus;Bacillus natto;Aspergillus oryzae;free fatty acids

TS214.2

0254-5071（2017）03-0080-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.017

2016-12-11

國家自然科學基金項目（31371828）

謝艷華（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：蔣立文（1968-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。

豆豉是一種傳統調味副食品，古代稱為“幽菽”，也叫“嗜”。豆豉以黑豆或黃豆為主要原料，利用毛霉、曲霉或者細菌蛋白酶的作用，分解大豆蛋白質，達到一定程度時，通過加鹽、加酒、干燥等方法，抑制酶的活力，延緩發酵過程而制成[1]。研究發現，豆豉具有抗氧化[2-3]、降血壓[4]、降血糖[5]等多種保健功能。

豆豉在發酵成熟過程中發生著復雜的化學變化，主要包括碳水化合物、蛋白質和脂肪的降解，使其口感更加細膩綿軟[6]。豆豉風味是許多種化合物共同作用并在量上達到一定平衡才產生的，其中脂類物質在風味的形成中起很重要作用。脂肪組分中，游離脂肪酸不僅是營養成分，而且是風味形成的前體物質，可以改善口感質構，同時有保健功效。豆豉中游離脂肪酸主要包含硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等，這些脂肪酸能顯著影響和改善人類神經或精神類疾病，作用于內分泌失調以及代謝綜合癥相關的疾病，如糖尿病[7-9]。游離脂肪酸中的不飽和脂肪酸在豆豉風味物質形成中起著非常重要的作用，其含量越多，最終形成的風味就越濃。發酵型產品微生物能夠分泌脂肪酶，對產品中游離脂肪酸有一定的影響，有研究發現丹貝中的不飽和脂肪酸、必需脂肪酸中的亞油酸和亞麻酸的含量與大豆中脂肪酸相比均顯著性增加[10]，并且接種不同微生物發酵劑對產品中游離脂肪酸的影響不同[11]。