芝麻香型丟糟酒實驗室生產模型的建立

宗緒巖，王祥余，2*，刁沖

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.諾維信（中國）投資有限公司，北京100085）

芝麻香型丟糟酒實驗室生產模型的建立

宗緒巖1，王祥余1，2*，刁沖1

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.諾維信（中國）投資有限公司，北京100085）

該研究針對目前芝麻香型丟糟酒的生產過程設計相應的實驗室模型并通過工廠實驗予以佐證。采用高效液相色譜和改進Megazymes法檢測樣品中的殘淀粉、含酒量等關鍵指標，并通過多重比較法評價模型的合理性和穩定性。結果表明，實驗室模型-1能準確預測丟糟酒成熟酒醅的含酒量和殘淀粉，為設計和優化針對芝麻香型丟糟酒的特種生物制劑提供快捷有效的預測手段；同時實驗室模型-2也揭示了物料的均勻混合和酵母的活力對殘葡萄糖、淀粉利用率和出酒率的顯著影響。

丟糟；模型；芝麻香型白酒；多重比較法

丟糟是我國傳統白酒固態釀造過程中的必然產物，不但產量巨大，而且成分復雜。復雜的物質組成及反復蒸煮和長時間的固態發酵使得丟糟的處理和合理回收利用非常困難[1-3]。芝麻香型白酒作為我國建國后發展起來的新型白酒，其結合了濃香型、清香型和醬香型三大香型的生產工藝，也將這三大香型白酒的風味特征有機的融合起來，近年來深得消費者的喜愛，產量也迅速得到擴大[4-5]。與此同時，芝麻香型白酒也因其獨特的釀造工藝造成了其丟糟中淀粉含量較高（10%～12%），含水量較低。由于傳統的處理方式不能充分利用芝麻香型丟糟中存在的豐富香味物質和殘余淀粉，利用芝麻香型白酒丟糟生產芝麻香型白酒丟糟酒成為了生產企業一種較為普遍的選擇[3，6]。然而正常發酵中使用的發酵劑（傳統大曲、麩曲等）因為酶系的缺陷及酶活的不足已經無法更多的產生丟糟酒，尋找合適的酶替代或加強淀粉分解利用率十分重要[3]。目前在白酒生產過程中利用單酶[7-9]、復合酶[10-11]和酵母[12]、細菌[13]作為發酵劑的研究已經有很多，但受限于白酒企業復雜的發酵工藝和工廠現場條件而無法大規模、高效的進行酶、微生物的篩選和測試，并準確的獲得相關數據以供生產使用。

芝麻香型丟糟酒實驗室生產模型的建立參考了濃香型白酒模型建立中的經驗[14]，以JMP軟件中的多重比較法（TukeyHSD）分析檢驗實驗室模型相對于生產現場的可靠性，建立芝麻香型丟糟酒實驗室生產模型，為尋找適合分解利用該香型丟糟殘淀粉的新酶分子提供快捷方便的實驗室篩選手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丟糟：山東地區某著名酒廠丟糟，丟糟前期發酵工藝傳統芝麻香發酵工藝，使用窖池為磚壘花洞塞泥窖；酵母：安琪高活性酵母；酶制劑：本土固體糖化酶（酒廠提供）。

酒石酸鉀鈉（分析純）：阿拉丁試劑公司；五水硫酸銅（分析純）、NaOH（分析純）：美國默克公司；葡萄糖、麥芽糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油、琥珀酸、三糖、四糖、五糖、多糖、淀粉分解糊精、雙乙酰、甲醇、乙醇、NaOH等（均為色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

ME3002天平及萬分之一天平：梅特勒-托利多公司；Waters 1515高效液相色譜（配備Waters 2414 Refractive Index Detector，Waters 2707 Autosampler和Bio-Rad生產AminexRHPX-87H Column 300 mm×7.8 mm色譜柱）：美國Waters公司；Milli-Q純水機：美國Merck公司；SPEXRSample Prep 1600樣品制備儀：美國SPEX公司；水浴鍋：丹麥Heto公司；烘箱：德國BINDER公司；其余玻璃器皿均購自德國DURAN公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗室丟糟酒發酵

實驗室模型-1：使用1 L的發酵瓶，每個發酵瓶中加入從工廠取回的已經配制好的入窖丟糟酒醅約600 g（丟糟酒醅具體配制為600 g新鮮丟糟，0.12 g安琪高活性酵母（提前用5mL的32℃溫水活化），酶制劑0.24g（劑量為糖化酶酶活17CU/g丟糟酒醅）），做5個平行樣；封口前用75%vol酒精將發酵瓶口部及酒糟沒有接觸到的發酵瓶上部消毒，然后用保鮮膜封口置于環境溫度為22℃的培養箱中避光發酵30d。

實驗室模型-2：使用1 L的發酵瓶，操作方法類似于實驗室模型-1，只是使用的是工廠取回的新鮮丟糟酒醅600g，將其與0.12g安琪高活性酵母混合（使用前用帶有丟糟和所需糖化酶的32℃溫水5 mL活化15 min），酶制劑0.24 g（劑量為糖化酶酶活17 CU/g丟糟酒醅，充分溶解于活化酵母種子液中），于實驗室中充分混勻。

1.3.2 酒廠芝麻香型丟糟酒發酵

在正常生產芝麻香型白酒的成熟酒醅完成蒸酒后，待酒醅溫度降低至35℃以下時按照0.4 kg/t劑量加入酶制劑和0.2 kg/t安琪高活性酵母（提前活化），并用鐵鍬混勻，入磚壘花洞塞泥窖密封發酵30 d。

1.3.3 殘淀粉含量檢測

殘淀粉含量的檢測方法為酶法，方法及原理與Megazyme試劑盒一致，利用諾維信復合淀粉酶和糖化酶代替Megazyme所用酶制劑以取得更穩定的檢測結果。具體操作參照參考文獻[14]。

1.3.4 成熟酒醅成分分析

成熟酒醅的成分檢測使用Waters 1515高效液相色譜，柱溫為65℃，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，分析時間為30 min。

1.3.5 多重比較分析[15]

通過分析所有不同處理方式得到的結果相互之間的差異及特定處理方式得到的結果與總體結果的差異得出特定處理方式對結果的影響大小。

2 結果與分析

2.1 發酵成熟酒醅殘淀粉分析

成熟酒醅的殘淀粉含量如圖1所示。由圖1可知，酒廠、實驗室模型-1和實驗室模型-2的平均出窖酒醅殘淀粉含量分別為4.83%、4.92%和4.29%，標準差分別為0.07%、0.08%和0.04%，表明在酒廠條件下和實驗模型-1條件下淀粉的分解利用效率明顯低于實驗室模型-2；結合考察三種處理方式的差異，可以得出酵母的活化即活酵母的接入量、活性和物料混合的均勻度對芝麻香型丟糟中的殘淀粉的分解和利用有著顯著的影響，其中物料混合方面的結論與信春暉等[16]關于大曲粉碎度方面的研究結果相吻合，在殘淀粉含量上與周瑞平等[17]的結論進行對照可確認混合度的高低可以影響最終殘淀粉的含量；在實驗模型方面，實驗室模型-1在殘淀粉表現方面更接近于酒廠現場狀態，但是從原料利用效率考慮，實驗室模型-2的生產方式更加適合于酒廠采用，有利于原料的充分利用。

圖1 成熟酒醅的殘淀粉含量Fig.1 Residual starch contents of mature fermented grains

2.2 發酵成熟酒醅含酒量分析

圖2 成熟酒醅的含酒量Fig.2 Alcohol contents of mature fermented grains

成熟酒醅的含酒量如圖2所示。由圖2可知，酒廠、實驗室模型-1和實驗室模型-2的平均出窖酒醅含酒量分別為0.77%、0.82%和1.98%，標準差分別為0.04%、0.05%和0.01%，結合圖1分析可知，在酒廠條件下和實驗模型-1條件下淀粉的分解利用效率明顯低于實驗室模型-2，從而導致了淀粉轉化為酒精的效率大幅降低；圖1和圖2的結果證明酵母的活化即活酵母的接入量、活性和物料混合的均勻度對芝麻香型丟糟中的殘淀粉的利用和出酒率有著顯著的影響；實驗室模型-1在出酒率表現方面更接近于酒廠現場狀態，但是從原料利用效率考慮，實驗室模型-2的生產方式更加適合于酒廠采用，有利于原料的充分利用。

2.3 發酵成熟酒醅殘葡萄糖分析

成熟酒醅的殘葡萄糖含量如圖3所示。由圖3可知，酒廠、實驗室模型-1和實驗室模型-2的平均出窖酒醅殘葡萄糖的含量分別為2.56%、2.43%和0.26%，標準差分別為0.30%、0.30%和0.02%，結合圖1和圖2分析可知，在酒廠條件下和實驗模型-1條件下產酒率較實驗室模型-2明顯低的另一個原因則是淀粉分解得到的葡萄糖未能被酵母等可代謝產生酒精的微生物利用，證明在發酵過程中有發酵能力的微生物（有活性的釀酒酵母）嚴重的不足是限制酒廠條件下和實驗室條件下產酒率提高的限制性因素，高效的活化酵母工藝和物料攪拌均勻是酒廠提高丟糟酒產率的一個可行措施，這一點通過研究對比周瑞平等[17]多糧兼香白酒研究中的殘葡萄糖也可以確定；在成熟酒醅殘還原糖這個指標上，實驗室模型-1同樣較實驗室模型-2更能表現出酒廠的現實狀況。

圖3 成熟酒醅的殘葡萄糖含量Fig.3 Residual glucose contents of mature fermented grains

2.4 發酵成熟酒醅乳酸積累量的分析

成熟酒醅的乳酸積累量如圖4所示。由圖4可知，酒廠、實驗室模型-1和實驗室模型-2的平均出窖酒醅乳酸積累量分別為3.95%、3.72%和3.34%，標準差分別為0.14%、0.07%和0.07%，結果表明，在實驗室條件下乳酸菌發酵過程中的活動強度明顯低于酒廠條件下，其原因是實驗室條件下發酵容器中的乳酸菌含量較低，針對實驗室模型-2還有另一個原因則是相對較好的混勻效果及較多的活性酵母使得發酵過程中酒精含量上升較快，限制了乳酸菌活動的時間長度；在成熟酒醅乳酸積累這個指標上，實驗室模型-1和實驗室模型-2的乳酸積累量與酒廠條件下的乳酸積累量都有著明顯不同，但實驗室模型-1的表現更加接近于酒廠條件，改善模型的方法是向發酵模型中接種合理數量的乳酸菌。

圖4 成熟酒醅的乳酸積累量Fig.4 Lactic acid accumulation of mature fermented grains

2.5 發酵成熟酒醅醋酸積累量的分析

成熟酒醅的醋酸積累量如圖5所示。由圖5可知，酒廠、實驗室模型-1和實驗室模型-2的平均出窖酒醅醋酸的含量分別為0.47%、0.41%和0.39%，標準差分別為0.08%、0.05%和0.04%，結果表明，在酒廠、實驗模型-1和實驗室模型-2條件下醋酸的積累情況類似于乳酸，其形成原因也與乳酸類似，積累量相互之間不存在明顯差異，但是實驗室模型-1的表現較實驗室模型-2的表現更加接近于酒廠條件。

圖5 成熟酒醅的醋酸積累量Fig.5 Acetic acid accumulation of mature fermented grains

3 結論

實驗結果的討論表明，利用實驗室條件模擬芝麻香型丟糟酒的生產過程是可行的，可以利用這一模型預測不同處理條件下丟糟酒成熟酒醅的殘淀粉含量、含酒量、葡萄糖、乳酸和醋酸等關鍵指標，為優化丟糟酒的生產條件，特別是研究針對芝麻香型丟糟酒的特種復合生物制劑提供快捷有效的預測手段。同時在建立模型的過程中所觀察到的酵母活化效果優劣和物料均勻度的差異對出酒率、殘淀粉、葡萄糖的影響也表明酵母活化效果及物料的攪拌均勻度是工廠的短板，這將明顯的影響丟糟發酵潛力的充分發揮。但是實驗結果也表明該模型由于在微生物環境方面的存在不足，導致有機酸積累量與實際工廠有所差距，需要進一步研究乳酸菌和醋酸菌的接種量的問題，才可以進一步完善該模型，為未來研究不同發酵劑對酒體風味的影響提供參考。

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Establishment of experimental production model for sesame-flavorBaijiumade by distiller's grains

ZONG Xuyan1,WANG Xiangyu1,2*,DIAO Chong1
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 2.Novozymes(China)Investment Co.,Ltd.,Beijing 100085,China)

The experimental model based on the process of sesame-flavorBaijiumade by distiller's grains was established and verified by industrial scale experiments.The starch content,alcohol content and other important indexes in distiller's grains were determined by HPLC and improved megazyme method.Then Tukey HSD was used to test the reasonability and stability of experimental model.Results showed that the experimental model 1 can exactly forecast the starch and alcohol content in mature distiller's grains,which will provide an effective forecast tool in designing and optimizing complex biological agents focus on sesame-flavorBaijiuby distiller's grains.At the same time,experimental model 2 also indicated that the uniform mixing of materials and the yeast activity had significant effect on residual glucose,starch utilization ratio and liquor yield.

distiller's grains;model;sesame-flavorBaijiu;tukey HSD

TS261

0254-5071（2017）03-0071-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.015

2016-10-16

固態釀造關鍵技術研究四川省院士（專家）工作站開放基金項目（No.GY2014-01）；釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金項目（NO.NJ2014-07）；瀘州老窖科研獎學金項目（No.13ljzk6）資助

宗緒巖（1976-），男，副教授，博士，主要從事食品生物化學、酶學應用及發酵過程控制的研究工作。

*通訊作者：王祥余（1985-），男，工程師，碩士，主要從事酶學應用、微生態研究和發酵過程控制工作。