不同來源紅曲米多酚類化合物和抗氧化活性的聚類分析

胡均亮，陸方菊，陳功，田霄飛，吳振強*

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

不同來源紅曲米多酚類化合物和抗氧化活性的聚類分析

胡均亮，陸方菊，陳功，田霄飛，吳振強*

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

為了研究不同紅曲米樣品抗氧化性差異，考察了10種紅曲米樣品中總多酚和總黃酮含量與DPPH、ABTS自由基清除力，并進一步分析了多酚類化合物的種類和含量。結果表明，紅曲米總多酚和總黃酮含量與其DPPH和ABTS自由基清除力呈顯著的正相關性(P＜0.01)；其中廣東紅曲的總多酚、總黃酮含量和抗氧化性的指標最高，其次為福建紅曲，浙江紅曲最低。同時多酚類化合物的種類及含量在不同的紅曲米樣品間差異較大，以多酚類化合物種類和含量作為區分依據，10種紅曲米樣品被分為4組，呈現產地聚集。表明紅曲米樣品中多酚類化合物的種類和含量受產地來源的影響較大。

紅曲米；多酚類化合物；抗氧化活性；相關性分析；聚類分析

紅曲米是以大米作為主要原料，由紅曲霉菌發酵而成的紫紅色米曲，也稱丹曲。紅曲米作為一種傳統發酵食品，在福建、浙江一帶深受當地人民歡迎。紅曲米應用廣泛，不僅可以釀造紅曲酒、烹飪飲食、發酵食品[1-2]，同時具有降低膽固醇和防止心血管疾病的活性物質。目前研究表明，紅曲菌的次級代謝產物，包括莫納克林K、色素、γ-氨基丁酸和二聚酸等，具有降血脂、治療阿茲海默癥、防止肥胖、調節血壓、防止氧化損傷和抗癌等功效[3]。

研究發現，通過紅曲菌（安卡紅曲霉（Monascus anka）和紫紅曲霉（Monascus purpureus）等）固態發酵谷物、高粱和玉米等農副產品，可以促進酚類物質釋放與轉化，明顯提高農副產品的抗氧化性等功能性價值。ANIYA Y等[4-5]研究發現，紅曲提取液中的二聚酸（dimeric acid）是1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基抗氧化活性和紅曲保肝作用的主要物質。YANG J H等[6]比較了經過紅曲發酵的精米和除殼大米產品與未發酵原料的抗氧化特性，發現紅曲發酵大米的還原能力、金屬螯合能力、鐵離子清除能力和酚類物質含量均高于未發酵大米；PYO Y H等[7]研究發現，紅曲谷物發酵提取液不僅能夠降低血脂濃度和脂質過氧化作用，還可以提高抗氧化物α-生育酚（α-tocopherol）和輔酶Q（coenzyme Q，CoQ）的水平；HUANG C S等[8]通過紫紅曲霉發酵金門高粱酒糟，發現使用100 μg/mL的發酵液處理M.purpureusCWT715可以減少61%的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷和51%的脂質過氧化作用，表現出抗氧化功能性產品的開發潛力；KONGBANGKERD T等[9]開發了兩步法紅曲發酵糯玉米的方法，相比于傳統工藝，新方法的DPPH、亞鐵還原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）和Fe2+清除能力的半抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）下降了50%；ABD R D L等[10]利用紫紅曲霉和少孢根霉發酵米糠，發現生物發酵能夠明顯提高米糠的抗氧化性和多酚類物質的含量。

本研究對不同地區和種類紅曲米多酚類化合物的種類和含量、抗氧化活性的差異進行了相關性分析和聚類分析。旨在探索不同地區在菌種、原料和制作工藝等差異對紅曲米品質的影響，以期為探討建立高抗氧化活性的紅曲米樣品的標準生產工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售紅曲米樣品：當地農副產品市場，室溫條件下保存于干燥處。紅曲米樣品信息詳見表1。

表1 紅曲米樣品的產地、種類及干物質含量Table 1 Origins,varieties and dry matter contents of red kojic rice samples

福林酚（分析純）：廣州市齊云生物技術有限公司；DPPH、維生素C（vitaminC，VC）（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）（色譜純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸、蘆丁、芥子酸、反式肉桂酸、阿魏酸、山奈酚和槲皮素（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；咖啡酸（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SpectraMax M5多功能酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；UV-2802S型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；e2695HPLC-2998PDA高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀、SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Waters公司；DHG-9070B恒溫鼓風干燥箱：上海申賢恒溫設備廠；BJ-400A多功能粉碎機：德清拜杰電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲米樣品干物質含量測定

紅曲米樣品經多功能粉碎機粉碎后過40目篩網。稱取0.5～0.6 g紅曲米粉于稱量瓶中，置于105℃恒溫鼓風干燥箱中8～12 h并在干燥皿中冷卻。紅曲米樣品干物質含量計算公式為：

式中：W為紅曲米樣品的干物質含量，%；m1是稱量瓶的質量，g；m2是稱量瓶的質量和未干燥樣品的質量之和，g；m3是稱量瓶的質量與干燥后樣品的質量之和，g。

1.3.2 紅曲米樣品提取物制備

精確稱取1.00 g干燥的紅曲米粉于100 mL具塞試管中，加入25 mL體積分數為80%的甲醇溶液混勻，在25℃條件下超聲（40W）提取30min。每個樣品提取兩次，合并提取液后使用定性濾紙（直徑12.5 cm）過濾。濾液儲藏于4℃冰箱備用。

1.3.3 紅曲米樣品提取液中總多酚和總黃酮含量測定

提取液中總多酚含量的測定采用福林酚法[11]：取0.1mL提取液或沒食子酸標準液（質量濃度梯度為0、0.01mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL和0.08 mg/mL），加入0.05 mL福林酚試劑混勻，室溫條件下反應3～8 min，加入0.15mL質量分數為20%的Na2CO3溶液，再加入0.7 mL蒸餾水定容至1 mL，反應60 min，在波長765 nm處測定吸光度值（OD765nm）?？偠喾拥暮恳詻]食子酸（mg/mL）表示，以總多酚含量（x）為橫坐標，吸光度值OD765nm（y）為縱坐標，繪制總多酚溶液標準曲線為y=5.707 4x+0.009 9（相關系數R2=0.999）。樣品中總多酚含量計算公式為：

式中：A1為反應液的總多酚含量，mg/mL；N為紅曲米樣品提取液的稀釋倍數；25是提取溶劑體積，mL；m為紅曲米樣品的質量，g；W為紅曲米樣品的干物質含量，%。

總黃酮含量的測定參照DEWANTO V等[12]方法，取0.1mL提取液（或蘆丁標準液）（質量濃度梯度0、0.04mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL），加入0.5 mL蒸餾水和0.03 mL NaNO2（5%，W/W）溶液混勻，反應6 min，加入0.06 mL 10%AlCl3溶液，室溫反應5 min，加入0.2 mL 1 mol/L的NaOH溶液，再加入0.11 mL蒸餾水定容至1 mL，于波長510 nm處測定吸光度值。總黃酮的含量以蘆?。╩g/mL）表示，以總黃酮含量（x）為橫坐標，吸光度值OD510nm（y）為縱坐標，繪制總黃酮溶液標準曲線為y=0.5829x+ 0.002 4（相關系數R2=0.996 5）。樣品中總黃酮含量計算公式為：

式中：A1為反應液的總黃酮含量，mg/mL；N為紅曲米樣品提取液的稀釋倍數；25為提取溶劑的體積，mL；m為紅曲米樣品的質量，g；W為紅曲米樣品的干物質含量，%。

1.3.4 紅曲米樣品提取液DPPH和ABTS自由基清除力的測定

DPPH自由基清除力的測定按照LI H等[13]報道的方法：取0.1 mL提取液（或VC標準液）（質量濃度梯度為0、0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL和0.06 mg/mL）加入3.9 mL DPPH甲醇溶液（6×10-5mol/L），混勻后在暗光下反應30 min，于波長515 nm處測定吸光度值。DPPH自由基清除力以VC當量（mg/mL）表示。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：A0為0.1 mL提取液（或VC標準液）+3.9 mL DPPH溶液的吸光度值；A1為0.1 mL提取液（或VC標準液）+3.9 mL甲醇溶液的吸光度值；A2為0.1 mL體積分數80%甲醇溶液+3.9 mL DPPH溶液的吸光度值。

ABTS自由基清除力的測定按照LI H等[13]報道的方法：將10mLABTS溶液（7mmol/L）和過硫酸鉀溶液（2.45mmol/L）按等體積1∶1混合，室溫暗光下靜置12～16h。用乙醇稀釋至OD732nm＝0.700±0.020備用。取0.1 mL提取液（或VC標準液）（質量濃度梯度為0、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL和0.05 mg/mL）加入3.9 mL ABTS稀釋液，混勻后室溫反應6 min，于波長732 nm處測定吸光度值。ABTS自由基清除力以VC當量（mg/mL）表示。ABTS自由基清除率的計算公式如下：

式中：A0是0.1 mL提取液（或VC標準液）+3.9 mLABTS稀釋液的吸光度值，A1是0.1 mL 80%甲醇溶液+3.9 mL ABTS稀釋液的吸光度值。

1.3.5 紅曲米樣品各種多酚類化合物的測定

多酚類化合物含量的測定在ROGGERO J P等[14]方法的基礎上進行了優化。HPLC檢測條件為：柱溫箱溫度為30℃；流動相A為0.005 mol/L磷酸緩沖液（pH 2.5），流動相B為純乙腈；梯度洗脫程序為：0～35 min（85%A+15%B），35～36 min（50%A+50%B），36～40 min（20%A+80%B），40～41 min（20%A+80%B），41～46 min（85%A+15%B），流速為0.8 mL/min。紫外檢測器掃描波長為210～400 nm，提取波長280 nm。

1.3.6 相關性分析和聚類分析

使用IBM SPSS V22.0軟件對實驗數據進行相關性分析和聚類分析[15]。

2 結果與分析

2.1 紅曲米樣品的總多酚和總黃酮含量與抗氧化性分析

10種不同紅曲米樣品的總多酚和總黃酮含量檢測結果見圖1。

圖1 10種紅曲米樣品的總多酚（A）和總黃酮含量（B）Fig.1 Contents of total polyphenols(A)and flavonoids(B)in 10 red kojic rice samples

由圖1可知，福建地區的6種紅曲米樣品總多酚含量基本接近，在4.2～6.5 mg/g之間，而浙江地區的2種烏衣紅曲米樣品總多酚含量相對較低。紅曲米樣品GQ、ZQ的總多酚含量最高，分別為11.713 mg/g和8.439 mg/g。在總黃酮含量上，紅曲米樣品FQ5、FQ1總黃酮含量最高，分別為10.563 mg/g和9.120 mg/g。紅曲米樣品ZW1、ZW2總黃酮含量最低。說明相同地區相同種類紅曲米樣品的總多酚含量相近，不同地區間的紅曲米和同地區不同種類的紅曲米在總多酚、總黃酮含量上明顯不同（P＜0.05）。

考察10種不同紅曲米樣品的DPPH和ABTS自由基清除力，結果見圖2。

圖2 10種紅曲米樣品的DPPH和ABTS自由基清除力Fig.2 DPPH and ABTS free radical scavenging ability of 10 red kojic rice samples

由圖2可知，不同地區和種類的紅曲米樣品具有不同的DPPH和ABTS自由基清除力。福建地區的6種紅曲米樣品DPPH自由基清除力相近，在4.1～5.8 mg/g之間；來自浙江地區烏衣紅曲米樣品ZW1、ZW2的DPPH自由基清除力相對較低，分別為1.547 mg/g和1.338 mg/g，而浙江地區紅曲米樣品ZQ的DPPH自由基清除力為3.997 mg/g。紅曲米樣品GQ的DPPH自由基清除力最高，為8.711 mg/g。ABTS自由基清除力的結果表明，福建地區的5種紅曲米樣品FQ1～FQ5的清除能力相差不大，在13.1～17.3 mg/g的范圍內。紅曲米樣品FQ6和ZQ的ABTS自由基清除力差不多，分別為11.452 mg/g和11.531 mg/g。浙江烏衣紅曲米樣品ZW1/ZW2的清除能力相對較弱，為5.004mg/g和4.474mg/g。紅曲米樣品GQ的ABTS自由基清除力最大，為28.607mg/g。

2.2 總多酚和總黃酮含量與DPPH、ABTS自由基清除力的相關性分析

總多酚含量、總黃酮含量以及DPPH、ABTS自由基清除力的相關性分析結果見表2。

表2 總多酚和總黃酮含量與DPPH和ABTS自由基清除力的相關性分析Table2Correlationanalysisoftotalpolyphenolsandflavonoidscontents and DPPH and ABTS free radical scavenging ability

由表2可知，紅曲米的DPPH和ABTS自由基清除力與總多酚含量相關系數分別為0.918和0.943，與總黃酮含量的相關系數分別為0.957、0.944。說明紅曲米樣品的抗氧化能力與總多酚和總黃酮含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。

2.3 紅曲米樣品多酚類化合物的種類和含量

采用HPLC法對10種紅曲米樣品提取物和多酚類化合物標準品（12種常見的化合物）進行分析，結果見圖3。通過與標準品的對照，本研究對紅曲米樣品中主要的多酚類化合物進行了定性和定量的研究，結果如表3所示。

圖3 紅曲米樣品中多酚類化合物及多酚類化合物標準品的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of polyphenol compounds of red kojic rice samples and the polyphenol compounds standards

表3 10種紅曲米樣品中多酚類化合物的含量Table 3 Contents of polyphenol compounds in 10 red kojic rice samples mg/kg

由圖3和表3可知，10種紅曲米提取液中多酚類化合物均得到了較好地分離。紅曲米樣品FQ1～FQ5中均含有12種多酚類化合物，樣品FQ6含有10種多酚類化合物；樣品ZQ和GQ中含有11種多酚類化合物，樣品ZW1和ZW2中分別含有10和8種多酚類化合物。說明不同地區和種類的紅曲米樣品含有不同種類的多酚類化合物。

由檢測結果可知，不同地區的紅曲米樣品在主要多酚類化合物的種類和含量上不同，福建紅曲米樣品FQ1～FQ5主要多酚類化合物為沒食子酸、綠原酸，含量分別為208.31～327.20 mg/kg、145.52～241.57 mg/kg。浙江烏衣紅曲米樣品ZW1和ZW2主要多酚類化合物為沒食子酸、蘆丁和香草酸，和福建地區紅曲米樣品主要多酚類化合物明顯不同，含量上也不一樣。而廣東紅曲米樣品GQ的主要多酚類化合物為沒食子酸、芥子酸，含量分別為128.86mg/kg、109.12 mg/kg，相對于福建地區和浙江地區紅曲米樣品，在主要多酚類化合物的種類和含量上也表現出差異性。同時相對于浙江烏衣紅曲米樣品ZW1和ZW2，浙江紅曲米樣品ZQ的主要多酚類化合物為沒食子酸，含量為361.69 mg/kg。說明相同地區不同種類紅曲米樣品在主要多酚類物質的種類和含量上也存在明顯差異。

2.4 紅曲米樣品的聚類分析

在紅曲米樣品多酚類化合物的種類和含量研究結果的基礎上，對10種不同來源的紅曲米樣品分別進行了聚類分析，結果如圖4所示。

圖4 10種紅曲米樣品的聚類分析結果Fig.4 Results of cluster analysis in 10 red kojic rice samples

由圖4可知，紅曲米樣品被大致歸為4類，分別為：第一類FQ1～FQ5，第二類GQ，第三類ZQ，第四類ZW1、ZW2和FQ6。由聚類結果分析可知，福建紅曲、廣東紅曲、浙江紅曲被分為三類，浙江紅曲和浙江烏衣紅曲被分為兩類，說明不同的產地和種類是影響紅曲米多酚類化合物種類和含量不同的因素。

3 結論

本研究通過對不同地區來源的紅曲米樣品的總多酚、總黃酮含量和體外抗氧化能力進行測定和比較。結果表明，廣東紅曲米樣品中總多酚、總黃酮含量及抗氧化能力均較高，其次為福建紅曲。不同地區和種類的紅曲米樣品具有不同的DPPH和ABTS自由基清除力，紅曲米樣品中總多酚和總黃酮含量與抗氧化性指標DPPH和ABTS自由基清除力表現出顯著的相關性。不同地區和種類的紅曲米樣品含有不同種類的多酚類化合物，而且不同地區和相同地區不同種類紅曲米樣品在主要多酚類化合物的種類和含量上也有一定的差異。福建紅曲米樣品多酚類化合物的種類最多，廣東紅曲米樣品的總多酚含量相對最高。而浙江兩種烏衣紅曲米樣品多酚類化合物含量最少，僅為廣東紅曲米樣品的13.92%和15.54%。同時聚類分析發現，紅曲米樣品按照不同地區和不同種類可以被分為4類，說明紅曲米樣品中多酚類化合物的種類和含量受產地來源影響較大。

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Cluster analysis of polyphenol compounds and antioxidant activity of red kojic rice from different producing areas

HU Junliang,LU Fangju,CHEN Gong,TIAN Xiaofei,WU Zhenqiang*
(School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

In order to research the difference of antioxidant activity of red kojic rice simples from different producing areas,the contents of total polyphenols and flavonoids and the scavenging ability of DPPH and ABTS free radical in 10 red kojic rice simples were investigated,the varieties and contents of polyphenol compounds were further analyzed.The results showed that the total polyphenols and total flavonoids contents in red kojic rice had significant positive correlation with DPPH and ABTS free radical scavenging ability(P＜0.01).Total polyphenols,total flavonoids content and antioxidant activity indexes in red kojic rice produced from Guangdong were the highest,followed by red kojic rice from Fujian and the lowest was the red kojic rice from Zhejiang.The differences of varieties and contents of polyphenol compounds between the different red kojic rice samples were greater.Using the varieties and contents of polyphenol compounds as distinguish basis,10 red kojic rice samples were divided into four groups and presented origin gather,which indicated that varieties and contents of polyphenol compounds in red kojic rice samples varied replying on their origin.

red kojic rice;polyphenolic compounds;antioxidant activity;correlation analysis;cluster analysis

TS202.1

0254-5071（2017）03-0039-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.009

2016-11-27

國家自然科學基金（31271925）；廣東省教育部產學研結合項目（2013B090600015）；廣州市科技計劃項目（2014J4100192）

胡均亮（1990-），男，碩士研究生，研究方向為紅曲酒發酵和功能性物質分析。

*通訊作者：吳振強（1963-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程、生物工程、生物化工、生態環境，大健康產業領域理論與應用。