海洋枝頂孢霉BH0531發酵液殺線蟲組分的分離及活性測定

劉曉霞，李娜，苗麗華，申佩娟，馮欣，2，孟慶恒，2*，孫建華，2

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

海洋枝頂孢霉BH0531發酵液殺線蟲組分的分離及活性測定

劉曉霞1，李娜1，苗麗華1，申佩娟1，馮欣1，2，孟慶恒1，2*，孫建華1，2

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

實驗采用生物活性跟蹤法，通過超濾、Sephadex凝膠層析、離子交換樹脂、硅膠板薄層層析，以及特異性鑒別染色等方法對海洋枝頂孢霉BH0531發酵液的殺線蟲活性組分進行分級分離和初步的性質分析。結果表明，Sephadex凝膠柱層析（G-25，G-10）可有效分離獲得殺線蟲活性組分，3 d的線蟲校正死亡率達98.33%；以正丁醇:水:無水乙醇=1∶1∶1(V/V)為展開劑的薄層層析，可將活性組分有效分離，Rf=0.31，斑點洗脫物的線蟲校正死亡率達到94.00%；定性染色結果顯示，茚三酮反應陽性，證實有α-氨基存在，茚三酮吡啶呈紅色，顯現出寡肽性質；雙甲酮染色呈亮黃色，表明具有酮糖性質。結果表明，BH0531殺線蟲活性代謝物應為含有酮糖基團的短肽類化合物。

海洋枝頂孢霉；殺線活性組分；活性跟蹤；分離

植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原物，全球每年因植物線蟲造成的經濟損失高達千億美元[1]，已成為僅次于真菌病害的第二大植物病害[2]，防控形勢嚴峻。真菌殺線劑（具殺線活性的代謝產物）作為繼殺線蟲活菌劑（淡紫擬青霉活菌劑）之后的第二代生防制劑，已引起國際上的廣泛重視[3]。而海洋真菌因其特殊的生境，秉承了代謝物種類和代謝途徑的多樣性，業已成為尋找新型殺線蟲活性物質的的資源庫。已有來自海洋的真菌Lachnumpapyraceum（Karst.）產生的異香豆素（isocoumarin）的鹵化衍生物被證實具有明顯的殺線蟲活性[4]；澳大利亞學者從南澳大利亞海篩選出兩株具有殺線蟲活性的海洋真菌Aspergilluscaneus和Raspailiasp.[5]。肖永堂等[6]對188株海洋真菌代謝物進行了殺線蟲毒力測定，并觀察到一株海洋真菌的代謝物對小桿線蟲有作用，推測該菌株代謝物作用機理可能與伊維菌素類似，是一種神經毒劑。郭道森等[7]先后從青島近海分離得到了具有殺線活性的輪枝孢霉（Verticilliumsp.）和青霉（Penicilliumsp.）。這些研究進展顯示，從海洋真菌中篩選殺線蟲活性代謝物已成為可能。

海洋枝頂孢霉BH0531是一株從渤海水域自主分離得到的具有明確殺線蟲活性的絲狀真菌，其殺線活性與代謝產物密切相關[8]。進一步的黃瓜盆栽實驗結果證實，該菌所產生的活性代謝物對南方根結線蟲（Meloidogyneincognita）同樣有明確的殺線活性，并使根結指數明顯降低，同時還具有改善土壤微生態環境的作用[9]；研究還發現，發酵液對染病植株的生長及保護酶具有促進作用[10]，而對線蟲體內保護酶則呈現出抑制作用[11]?；钚晕镞€具有分子質量小、水溶性好、耐熱和pH適應范圍寬的特點[8]。為進一步明確其活性組分的理化特性，闡明相關物質與殺線蟲功能的關系，實驗采用生物活性跟蹤法，以松材線蟲為靶標線蟲，對殺線蟲活性組分進行了初步的分離純化和殺線活性測定，旨在為菌株BH0531的進一步開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531，菌種保藏號CGMCC-5445：由天津師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2 供試線蟲

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）：中國農科院植保所提供。

1.1.3 供試培養基

活化培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potatodextrose agar，PDA））：去皮土豆200 g/L煮汁，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，pH自然。121℃、0.1 MPa滅菌20min。

發酵培養基：去皮土豆200 g/L（浸汁），葡萄糖20 g/L，pH自然。121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.4 供試藥品

葡聚糖凝膠Sephadex G-25、G-10：北京索萊寶科技有限公司；離子交換樹脂：南開大學化工廠；水合茚三酮：天津市光復科技發展有限公司；雙甲酮（98%）：北京百靈威科技有限公司；正丁醇、吡啶、甲醛（均為分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠；HSGF245薄層層析硅膠板：煙臺市黃務硅膠開發試驗廠。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5810R型冷凍離心機：德國Eppendorf AG公司；SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；GZX-9140MBE型數顯鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BSZ-100型自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠；TP10-20型超濾泵、MT系列UEOS-503中空纖維膜組件（50 mm×386 mm，截留分子質量6 ku）：天津天膜工程技術有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度儀：美國Varian公司；DME/MVC2000型顯微鏡：德國徠卡公司；凝膠柱層析（0.5 cm×40 cm）：上海華美實驗儀器廠；96孔板：美國Costar公司；無菌式針頭過濾器（0.22 μm孔徑）：德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵液小分子粗提物的制備

將4℃保藏的海洋枝頂孢霉BH0531菌種接入活化培養基（PDA），26℃條件下生化培養箱靜置培養7 d活化。加入無菌水洗下孢子，制備成106個/mL的孢子懸液，以1%的接種量將孢子懸液接入裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，26℃、120 r/min培養4 d[12]。將發酵好的發酵液8 000 r/min離心30 min除菌體，再經孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，即為發酵大分子濾液。采用截留分子質量為6 000 u的中空纖維膜組件對發酵濾液進行超濾。超濾后濾液置于真空干燥箱內，抽真空710 MPa，50～60℃進行干燥。

1.3.2 代謝物分級分離及殺線蟲活性

Sephadex G-25凝膠柱層析：取1.48 g萃取后真空干燥濃縮的發酵液干物質溶于10 mL無菌水中，經過孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾后，上樣量為1 mL，超純水做洗脫劑。通過恒流泵控制流速1mL/管，用自動收集器收集30管。共收集10次，收得總液體300 mL，平均每個組分10 mL。將分離收集得到的分離活性物的每個組分的10 mL液體濃縮為2.5 mL，分別檢測殺線蟲活性。Sephadex G-10凝膠柱層析：將經過Sephadex G-25凝膠柱有活性管合并，過G-10凝膠柱收集（同上G-25），做殺線活性檢驗。

1.3.3 分離物性質及活性分析

溶解性質采用水飽和乙酸乙酯萃取法，將分離物萃取3次后收集酯相和水相，分別檢測殺線活性，以判斷活性代謝物的溶解性質。萃取后有活性相，分別采用001×7型陽離子交換樹脂和201×7型陰離子交換樹脂分離活性組分，并通過殺線活性分析判斷帶電荷情況。裝柱高2/3、平衡、上樣量1 mL、超純水洗脫。

1.3.4 活性組分的薄層分離及初步定性分析

以正丁醇∶水∶無水乙醇（1∶1∶1，V/V）的比例作為展開劑，在10cm×5cm的硅膠板下端1cm處點樣，點樣間距為1.5cm，密閉式展開，展開方式為上行展開，展開時間為90 min。用茚三酮溶液（0.2 g本品溶于100 mL無水乙醇）噴板，于110℃烘箱內烘烤30 min顯色檢驗α-氨基酸[13]；用1%茚三酮吡啶溶液與冰醋酸按5∶1混合，噴板后于100℃加熱5 min顯色檢驗二肽或三肽短肽類物質；用雙甲酮溶液（10 g雙甲酮溶于90 mL乙醇與10 mL 85%磷酸中）顯色，噴板后于110℃加熱15～20 min檢驗酮糖[14]。根據顯色的Rf值將斑點溶解做殺線活性檢驗。斑點洗脫物進一步在波長200～600 nm范圍內進行紫外全波長掃描，并以超純水作空白校準基線，用以判定紫外吸收特性。

1.3.5 殺線蟲活性（殺線率）的測定方法

以無菌水為對照組，松材線蟲為靶標線蟲，取無菌96孔板，每孔加入100 μL的靶標懸蟲液（約100頭），再將收集的分離液分別取100 μL等體積加入。設3組重復，26℃培養箱中培養3 d于顯微鏡下觀測靶標線蟲的死亡情況，線蟲校正死亡率的公式為：

2 結果與分析

2.1 分級分離物及殺線蟲活性

超濾獲得的菌株BH0531發酵液粗提物進一步經Sephadex G-25凝膠柱層析分離，分離結果如表1所示。

表1 菌株BH0531發酵液G-25凝膠柱層析分離的各組分線蟲存活率（3 d）Table 1 Mortality for each component of BH0531 fermentation broth by G-25 gel chromatography on nematodes(3 d)

從表1可以看出，殺線活性組分主要集中在13～25管收集物（殺線率≥60%），達到A級（殺線率≥90%）的有5管，其中殺線率≥95%的主要集中在14～17管，處于分離過程的中段區域。另有5管（18～21、24管）達到B級（殺線率≥80%），主要出現在分離過程的后段。這一現象表明，活性組分為Sephadex G-25分離范圍內的分子質量相對較小的組分。先行收集的相對分子質量較大的組分未表現出明顯的殺線活性（殺線率≤40%）。在此基礎上，將G-25凝膠柱分離收集的有活性管合并，進一步進行了分離范圍更小的Sephadex G-10凝膠柱分離檢驗，結果顯示，G-10凝膠柱的分離物3 d的線蟲死亡率為88.72%，校正死亡率達到88.20%，接近A級。提示活性物質的分子質量介于G-25分離范圍的下限和G-10的上限之間。

2.2 分離物性質及活性分析

為進一步判別活性組分的理化性質，實驗采用水飽和乙酸乙酯萃取和離子交換的方法對分離物進行了進一步的分離和活性檢驗，結果見表2。

表2 菌株BH0531發酵液不同萃取相的殺線蟲活性（3 d）Table 2 Nematicidal activity of different extraction phases of BH0531 fermentation broth(3 d)

由表2可知，分離物的殺線蟲活性主要出現在水相組分，校正死亡率達到B級，而酯相殺線活性較弱，表明殺線蟲活性組分為具有一定極性的水溶性物質。

用處理好的001×7型陽離子交換樹脂、201×7型陰離子交換樹脂洗脫分離物見表3。

表3 菌株BH0531發酵液水相萃取物離子交換樹脂的殺線蟲活性（3 d）Table 3 Nematicidal activity of aqueous phase of BH0531 fermentation broth by different anion-exchange resins(3 d)

由表3可知，經過陽離子交換并洗脫后殺線蟲校正死亡率達91.24%，而201×7型陰離子樹脂交換后，因結合牢固而未能將活性組分洗脫下來。表明海洋枝頂孢霉BH0531殺線蟲活性物質含有較強的正電荷。

2.3 分離物屬性的定性分析

對G25凝膠柱分離的菌株BH0531殺線活性物進行了進一步的硅膠板薄層層析色譜分離，紫外觀察可見到明顯的分離物顯色斑點（圖1A），茚三酮乙醇溶液染色呈陽性（圖1B），表明分離物含α-氨基，印證了前期研究提出的活性物可能為含氮糖類的推測[12]。隨后的茚三酮吡啶溶液染色可見紅色顯色斑點（Rf3=0.31），提示該組分應為二肽或三肽（圖1C）。雙甲酮溶液染色可見到亮黃色斑點組分（Rf4=0.31），表明含有酮糖基團（圖1D）。紫外-可見光全波長掃描結果顯示（圖2），在波長217.5 nm處有單一較大吸收峰（Abs=3.704），表明活性組分存在n→π*、π→π*躍遷的吸收帶，提示有C=O，N=O等基團[15]。依據Rf對未染色的相應組分進行洗脫并進行殺線活性檢驗的結果表明，3 d的線蟲校正死亡率為94.32%，證實該組分即為殺線蟲活性組分。

圖1 分離物硅膠板薄層層析色譜分離及顯色結果Fig.1 Isolation and chromogenic results of silica gel plate by thin layer chromatography

圖2 分離物紫外可見全波長掃描結果Fig.2 Scanning results of ultraviolet visible wavelength of the separated products

3 結論

上述研究結果表明，采用殺線蟲活性跟蹤檢測的方法，經6 000 u超濾、Sephadex G-25、G-10凝膠柱層析等分級分離方法可有效獲得海洋枝頂孢霉BH0531殺線蟲活性組分，活性物殺線蟲校正死亡率最高可達98.33%。進一步的水飽和乙酸乙酯萃取法萃取、離子交換結果證實該活性組分為帶正電的水溶性物質。硅膠板薄層層析可進一步分離、并純化獲得該組分。定性分析結果表明，殺線蟲活性組分應為含有酮糖基團的短肽類物質。這類物質的生物活性在其他領域已有研究報道，如MALMSTRM J等[17]在裸孢殼菌Emericella variecolor代謝物中發現三種聚酮varitriol，varioxirane，dihydroterrein具有抗菌作用；CHEN Z M等[18]在海洋真菌枝頂孢霉SCSIO 115的發酵液中分離了對腫瘤細胞具有毒性的三種新環肽。但在殺線蟲活性的研究中的有相關報道還不多見，其具體化學結構和殺線蟲作用的機理還有待進一步的深入研究。

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Separation and activity determination of nematicidal components from marine-derived Acremoniumsp.BH0531 fermentation broth

LIU Xiaoxia1,LI Na1,MIAO Lihua1,SHEN Peijuan1,FENG Xin1,2,MENG Qingheng1,2*,SUN Jianhua1,2
(1.College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China;2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387,China)

The nematicidal active components from marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth were fractionated and preliminarily identified through the methods of ultra-filtration,Sephadex gel chromatography,anion-exchange resin,thin layer chromatography(TLC),as well as specific differential staining under the guidance of bio-active assay.The results showed that the nematicidal active components were separated and purified effectively by Sephadex G-25 and Sephadex G-10 gel chromatography,the adjusted mortality of the nematodes at 3 d was up to 98.33%.The TLC results indicated that the active components can be effectively separated using 1-butanol,H2O,anhydrous ethanol(1∶1∶1)(V/V)as developing solvent,Rf=0.31.The spot of silica gel plate,which adjusted mortality of the nematodes was 94.00%.The qualitative staining results indicated that the inhydrin color reaction was positive,which proved the presence of α-amino group.The inhydrin pyridine color reaction was red,showing oligopeptide properties.The dimedone staining was bright yellow,showing the properties of ketose.These results suggested that the marine-derived fungusAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth with nematicidal activity should contain oligopeptides compounds with ketose groups.

marine-derivedAcremoniumsp.;nematicidal active components;activity tracking;separation

Q939.9

0254-5071（2017）03-0035-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.008

2017-01-01

國家自然科學基金資助項目（31272019）；天津市自然基金聯合項目（15JCYBJC51400）

劉曉霞（1992-），女，碩士研究生，研究方向為微生物的活性物質。

*通訊作者：孟慶恒（1963-），副教授，碩士，研究方向為應用微生物。