人參皂苷Rg1配伍烏頭堿對體外培養心衰模型心肌細胞的保護作用Δ

董艷紅，謝曉芳，李雪梅，朱雅寧，彭成#[1.成都中醫藥大學藥學院，成都 61117；2.中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 61117；.華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625099]

人參皂苷Rg1配伍烏頭堿對體外培養心衰模型心肌細胞的保護作用Δ

董艷紅1，2＊，謝曉芳1，2，李雪梅1，2，朱雅寧3，彭成1，2#[1.成都中醫藥大學藥學院，成都 611137；2.中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137；3.華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625099]

目的：考察人參皂苷Rg1配伍烏頭堿對體外培養心衰模型心肌細胞的保護作用。方法：將新生大鼠心肌細胞分為正常對照組、模型組、陽性對照組（去乙酰毛花苷注射液，1×10－7mol/L）、人參皂苷Rg1組（1×10－8mol/L）、烏頭堿組（1×10－9mol/L）以及人參皂苷Rg1與烏頭堿不同配比的配伍組（1∶1、2∶1、1∶2，V/V）。除正常對照組外，其余各組細胞均以0.8%戊巴比妥鈉誘導心肌細胞心衰模型。成模后，各組細胞給予相應藥物培養1 h，然后檢測細胞總三磷酸腺苷（ATP）酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活力；檢測細胞培養液中酸性磷酸酶（ACP）、乳酸脫氫酶（LDH）活力和腦鈉肽（BNP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量以及細胞中總糖原含量。結果：與正常對照組比較，模型組細胞總ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明顯降低，Na+-K+-ATP酶活力明顯升高，培養液中ACP、LDH活力及BNP含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組細胞總ATP酶活力顯著升高，細胞培養液中LDH活力顯著降低，且以人參皂苷Rg1與烏頭堿2∶1配伍時作用最強；烏頭堿組和各配伍組細胞Na+-K+-ATP酶活力均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；各給藥組細胞培養液中ACP、BNP活力均有降低的趨勢，細胞內總糖原含量和培養液中TNF-α含量無顯著變化（P＞0.05）。結論：人參皂苷Rg1配伍烏頭堿可改善大鼠心衰模型心肌細胞ATP酶活力和膜通透性，調節細胞分泌BNP，對心衰模型心肌細胞有一定保護作用，且以人參皂苷Rg1與烏頭堿2∶1配伍時作用最強。

人參皂苷Rg1；烏頭堿；配伍；心衰模型；心肌細胞；細胞膜通透性；離子轉運相關酶

人參皂苷Rg1是中藥人參的主要有效成分之一，屬三醇類皂苷，具有廣泛藥理作用，且近年發現其可抑制心肌肥大，是治療心衰的潛在有效物質[1]。烏頭堿存在于附子等烏頭類毒性中藥材中，人服用0.2 mg即可中毒，具有顯著心肌細胞毒性[2]。然而，烏頭堿在較低濃度時對正常心肌細胞和戊巴比妥納誘導的心肌細胞損傷均具有保護作用，且與人參皂苷Rg1配伍后作用增強；而在毒性濃度時與人參皂苷Rg1或Rb1配伍后可明顯降低其心肌細胞毒性，是中藥配伍增效減毒的科學體現，這在筆者前期研究中已得到證實[3-4]，這對揭示中成藥參附注射液治療心力衰竭的安全有效性具有重要意義。本文在前期研究基礎上，探討人參皂苷Rg1與烏頭堿配伍后對體外培養大鼠心衰模型心肌細胞的細胞膜通透性、膜離子轉運相關酶活力等的影響，以進一步明確烏頭堿與人參皂苷Rg1配伍對損傷心肌細胞的保護作用。

1 材料

1.1 儀器

AE2000倒置相差顯微鏡（廈門Motic公司）；ALLEGER X-12離心機（美國Beckman公司）；Varioskan Flash 2.4.3全波長多功能讀數儀（美國Thermo公司）。

1.2 藥品與試劑

烏頭堿、人參皂苷Rg1（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-14072802、MUST-14041311，純度：均≥99.8%）；去乙酰毛花苷注射液（上海復興朝暉藥業有限公司，批號：AF131004，規格：0.2 mg/mL）；酸性磷酸酶（ACP）、乳酸脫氫酶（LDH）、三磷酸腺苷（ATP）酶測定試劑盒和肌/肝糖原試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150130、20141227、20150731、20150729）；大鼠腦鈉肽（BNP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海拜力生物科技有限公司，批號：均為201511）。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，♀♂各半，鼠齡2～3 d，購自成都達碩實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（川）2015-030]。

2 方法

2.1 細胞離子轉運相關酶活力的測定結果

[5]中方法獲取新生大鼠的原代心肌細胞，按試驗需求將細胞培養于不同孔板或培養皿中，將處于對數生長期的細胞分為正常對照組、模型組、陽性對照組（去乙酰毛花苷注射液，1.00×10－7mol/L）、人參皂苷Rg1組（1.00×10－8mol/L）、烏頭堿組（1.00×10－9mol/L）以及人參皂苷Rg1與烏頭堿體積配比分別為1∶1、2∶1、1∶2（總體積不變）的配伍組，共8組，每組6孔。按既往建立的方法，采用0.8%戊巴比妥鈉誘導心肌細胞心衰模型[5]。與正常對照組細胞比較，其余組細胞搏動明顯減弱時，棄去造模液。各給藥細胞組分別加入相應的藥液（200 μL/孔）。將細胞置于37℃培養箱中孵育1 h，收集細胞，破碎后按照試劑盒說明書測定細胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和總ATP（T-ATP）酶的活力。

2.2 細胞膜通透性的測定

將原代心肌細胞接種于48孔板中，當細胞處于對數生長期時，按“2.1”項下方法分組、造模與給藥，每組10孔，藥物作用1 h后棄去藥液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞1次，然后每孔加入70μL不含血清的DMEM高糖培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，收集培養液，按試劑盒說明書測定培養液中ACP、LDH活力。

2.3 細胞內總糖原含量及培養液中BNP、TNF-α含量的測定

將處于對數生長期的細胞按“2.1”項下方法分組、造模與給藥，每組6孔。藥物作用1 h后收集細胞，破碎后按試劑盒說明書測定細胞內總糖原的含量；或作用1 h后，棄去藥液，用PBS清洗細胞1次，然后每孔加入70 μL不含血清的DMEM高糖培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，收集培養液，采用ELISA法按照相關試劑盒說明書測定培養液中BNP、TNF-α含量。

3 結果

3.1 細胞離子轉運相關酶活力的測定結果

與正常對照組比較，模型組細胞Na+-K+-ATP酶活力顯著升高，Ca2+-Mg2+-ATP酶、T-ATP酶活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組細胞T-ATP酶活力均顯著升高（P＜0.05）；烏頭堿組和3個配伍組細胞Na+-K+-ATP酶活力均顯著降低（P＜0.05）；除人參皂苷Rg1組及人參皂苷Rg1與烏頭堿1∶2配伍組外，其他各給藥組細胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均呈升高趨勢，其中陽性對照組差異有統計學意義（P＜0.05），結果詳見表1。

表1 各組細胞離子轉運相關酶活力測定結果（±s，n＝6）Tab 1 The activities of ion-related enzymes of cells in each group（±s，n＝6）

表1 各組細胞離子轉運相關酶活力測定結果（±s，n＝6）Tab 1 The activities of ion-related enzymes of cells in each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

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3.2 細胞膜通透性的測定結果

與正常對照組比較，模型組細胞培養液中ACP、LDH活力均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組細胞培養液中LDH活力均顯著降低（P＜0.05）；ACP活力不同程度地降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），結果詳見表2。

表2 各組細胞培養液中ACP、LDH活力測定結果（± s，n＝10）Tab 2 The activities of ACP and LDH in cell culture liquid of each group（±s，n＝10）

表2 各組細胞培養液中ACP、LDH活力測定結果（± s，n＝10）Tab 2 The activities of ACP and LDH in cell culture liquid of each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

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3.3 細胞內總糖原含量與培養液中BNP、TNF-α含量測定結果

與正常對照組比較，模型組細胞培養液中BNP含量顯著升高（P＜0.05）；TNF-α含量有升高趨勢，細胞內總糖原含量呈下降趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各給藥組細胞培養液中BNP含量均有減少的趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）；各給藥組細胞內總糖原含量和培養液中TNF-α含量均無升高或降低趨勢，結果詳見表3。

表3 各組細胞內總糖原含量和培養液中BNP、TNF-α含量測定結果（±s，n＝6）Tab 3 The contents of total glycogen of cells and BNP，TNF-α in cell culture fluid in each group（±s，n＝6）

表3 各組細胞內總糖原含量和培養液中BNP、TNF-α含量測定結果（±s，n＝6）Tab 3 The contents of total glycogen of cells and BNP，TNF-α in cell culture fluid in each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05

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4 討論

配伍是中藥治療疾病的主要運用形式，主要目的在于減毒增效。配伍增效在現代藥理學研究中應用廣泛，如丹參聯合葛根對糖尿病眼病模型大鼠具有協同增效作用[6]。中醫藥藥性理論認為，中藥的毒性和藥效均屬中藥藥性，在正確利用時藥物的毒性也可轉為藥效。烏頭堿是公認的毒性物質，對神經細胞、心肌細胞、生殖細胞、消化細胞等均有顯著毒性[7]。然而近年來烏頭堿的藥效作用被逐漸認識和重視，如溫善珊等[8]研究發現烏頭堿在5～100 μmol/L時對雙氧水（H2O2）誘導的原代培養大鼠乳鼠心肌細胞損傷有保護作用，且呈明顯量-時-效正相關。此外，烏頭堿還有抗心律失常、鎮痛、抗炎、調節血壓等多種藥理作用[9]。而本研究團隊前期研究也發現，烏頭堿在3×10－3mol/L及以上濃度時對原代培養大鼠心肌細胞具有顯著毒性，可導致細胞內離子紊亂、膜上離子轉運相關酶活力異常、細胞膜通透性增強，3× 10－3mol/L時甚至使細胞成碎片[10]；但在1×10－9mol/L時對原代培養大鼠心肌細胞具有保護作用，可提高細胞活力、調節細胞內紊亂的離子水平[3]，且在不同濃度下與人參皂苷Rg1配伍可達到增效減毒的作用。由此可見，烏頭堿不只是導致心臟毒性的毒性物質，在低濃度時也是一種保護心肌、具有強心活性的物質，其特點也符合中藥藥性理論對藥物毒性和藥效的認識。本研究是在前期研究基礎上的進一步試驗，具有良好的基礎。

戊巴比妥鈉為選擇性中樞系統抑制藥，大劑量可抑制電壓依賴性心肌細胞膜Na+通道及K+通道，通過抑制心肌動作電位而達到心力衰竭的效果[11]。而離子轉運相關ATP酶在心肌細胞膜結構上分布多，與心肌細胞功能有緊密關系[12]。前期研究發現，烏頭堿致毒時會引起心肌細胞內Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活力降低。現代藥理學研究發現，導致心力衰竭的原因主要與細胞內、外的Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子的濃度有關，這些離子的轉運又離不開ATP酶的活性[13]。

本研究果顯示，經0.8%戊巴比妥鈉作用后，損傷的心肌細胞的細胞Na+-K+-ATP酶活力升高，Ca2+-Mg2+-ATP酶、T-ATP酶活力下降。給藥后，烏頭堿及人參皂苷Rg1都能顯著降低細胞Na+-K+-ATP酶活力，升高Ca2+-Mg2+-ATP酶、T-ATP酶活力；當人參皂苷Rg1與烏頭堿配伍比例在1∶1時升高Ca2+-Mg2+-ATP酶活力和降低Na+-K+-ATP酶活力的作用最為明顯，且對Na+-K+-ATP酶的作用比兩藥單用效果更好；配伍比例在2∶1時對升高T-ATP酶活力的作用最為明顯，且比兩藥單獨使用效果更好，這也與前期研究結果（使模型細胞中Na+水平升高和K+水平降低）的作用一致[3]。心肌細胞損傷后細胞內的ACP、LDH大量漏出，心肌細胞膜性結構受損。本研究結果顯示，造模后心肌細胞ACP、LDH大量漏出，細胞培養液中ACP、LDH活力顯著增加，提示細胞膜通透性增加；受損細胞經人參皂苷Rg1、烏頭堿或兩者配伍作用后其細胞培養液中ACP、LDH活力均有效降低。人參皂苷Rg1作用較烏頭堿優，而人參皂苷Rg1與烏頭堿2∶1配伍時作用最佳，表明其對細胞膜的改善作用最明顯。

綜上所述，人參皂苷Rg1與烏頭堿配伍后對戊巴比妥鈉所致體外培養大鼠心衰模型心肌細胞具有一定的保護作用，可明顯改善細胞膜上離子轉運相關ATP酶的活力，改善細胞膜的通透性，并在一定程度上調節細胞分泌BNP的功能；與人參皂苷Rg1、烏頭堿單用比較，二者以2∶1配伍時對細胞ATP酶活力的調節作用增強。本研究對科學闡釋人參與附子配伍（如參附注射液）治療心力衰竭具有重要意義，對有毒物質烏頭堿的開發應用具有一定的參考價值。

參考文獻

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[13] 金哲雄.何首烏對缺氧培養心肌細胞保護作用的研究[D].延吉：延邊大學，2005.

Protective Effect of Compatibilities of Ginsenosides Rg1and Aconitine on Myocardial Cells of in vitro Cultured Heart Failure Model

DONG Yanhong1，2，XIE Xiaofang1，2，LI Xuemei1，2，ZHU Yaning3，PENG Cheng1，2（1.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.State Key Lab Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST，Chengdu 611137，China；3.Huarun Sanjiu（Ya'an）Pharmaceutical Co.，Ltd.，Sichuan Ya'an 625099，China）

OBJECTIVE：To investigate the protective effect of the compatibilities of ginsenosides Rg1and aconitine on myocardial cell ofin vitrocultured heart failure model.METHODS：The myocardial cells of neonate rat were grouped into normal control group，model group，positive control group（Deslanoside injection，1×10－7mol/L），ginsenosides Rg1group（1×10－8mol/L），aconitine group（1×10－9mol/L）or their compatibilities groups（1∶1，2∶1，1∶2，V/V）.Except for normal control group，other groups were given 0.8%pentobarbital sodium to induce heart failure model of myocardial cells.After modeling，each group was given relevant medicine for 1 h，and then the activities of T-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase，Na+-K+-ATPase in cells were all detected.The activities of acyl carrier protein（ACP）and lactate dehydrogenase（LDH），and the contents of brain natriuretic party（BNP），TNF-α and total glycogen were measured in cell culture fluid.RESULTS：Compared with normal control group，T-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities were decreased significantly in model group；meanwhile，Na+-K+-ATPase activity was increased significantly，and ACP，LDH activities and BNP content in cell culture fluid were increased significantly（P＜0.05）.Compared with model group，the activities of T-ATPase in treatment groups were increased significantly，while the activity of LDH in cell culture fluid was decreased significantly；when the volume ratio of ginsenoside Rg1to aconitine was 2∶1，protective effect was the strongest；the activities of Na+-K+-ATPase in aconitine group and compatibility groups were all decreased significantly，with statistical significance（P＜0.05）.The activities of ACP and BNP in cell culture fluid were all decreased in treatment groups，but the content of total glycogen in cells and the TNF-α content of in cell culture fluid had no change（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Compatibility of ginsenosides Rg1and aconitine can improve ATPase activities and membranous permeability，regulate BNP secretion and protect myocardial cell of heart failure model，especially the compatibility of ginsenosides Rg1to aconitine of 2∶1 ratio.

Ginsenosides Rg1；Aconitine；Compatibility；Heart failure model；Myocardial cell；Membranous permeability；Ion-related ATPase

R285.5

A

1001-0408（2017）04-0472-04

2016-08-07

2016-11-14）

（編輯：林靜）

國家自然科學基金重點項目（No.81630101）；國家科技支撐計劃課題（No.2011BAI13B05）；“重大新藥創制”科技重大專項（No.2013ZX09201018）；四川省2013年重點科技自籌項目（No. 2013JYZ010，2013SZ0114）；四川省博士后科研項目

＊碩士研究生。研究方向：中藥藥理與毒理學。電話：028-61800018。E-mail：dongyanhongchengdu@126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中藥藥理與毒理學。E-mail：pengchengchengdu@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.11