碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌耐藥機制及同源性分析

謝逢春++++胡龍華++++寧長秀++++金迎慶

[摘要]目的 探討碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌耐藥機制及同源性。方法 選取2014年10月～2016年3月南昌仁愛婦產醫院、南昌大學第二附屬醫院、撫州市第一人民醫院檢驗科分離出的60株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌作為研究對象，采用藥敏實驗分析耐藥率、改良Hodge試驗及乙二胺四乙酸（EDTA）協同試驗檢測碳青霉烯酶、聚合酶鏈反應（PCR）擴增耐藥基因并確定基因型、脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析菌株同源性。結果 60株菌株對抗菌藥物的耐藥率前3位依次為：頭孢西丁（100.0%）、頭孢他啶（90.0%）、氨曲南（90.0%），多黏菌素B耐藥率最低（5.0%）；改良Hodge試驗陽性率為76.7%，EDTA協同試驗陽性率為81.7%；60株菌株中檢出碳青霉烯酶基因39株，其中KPC-2 3株，IMP-4 24株，IMP-8 12株，攜帶其他β-內酰胺酶基因45株；60株菌株經PFGE分為A-O 20種不同的型別59株，僅有1株多次分型均未成功。結論 陰溝腸桿菌耐藥機制主要與KPC、IMP基因有關。

[關鍵詞]碳青霉烯酶；陰溝腸桿菌；耐藥機制；同源性

[中圖分類號] R379.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（c）-0126-03

Resistance mechanism and homology of Enterobacter cloacae resistant to carbapenem

XIE Feng-chun1 HU Long-hua2▲ NING Chang-xiu3 JIN Ying-qing1

1.Department of Clinical Laboratory，Nanchang Charity Hospital for Gynecology and Obstetrics，Nanchang 330025，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital Affiliated to Nanchang University，Nanchang 330025，China；3.Department of Clinical Laboratory，the First People′s Hospital of Fuzhou City in Jiangxi Province，Fuzhou 344000，China

[Abstract]Objective To explore the resistance mechanism and homology of Enterobacter cloacae resistant to carbapenem.Methods 60 separated strains of Enterobacter cloacae resistant to carbapenem from October 2014 to March 2016 of Clinical Laboratory from Nanchang Charity Hospital for Gynecology and Obstetrics，the Second Hospital Affiliated to Nanchang University and the First People′s Hospital of Fuzhou City were selected as study objects.Drug sensitivity test was used to analyze the resistance rate，modified Hodge test and EDTA synergy test were used to detected carbapenem， PCR was used to amplify resistance genes and determinate genotypes，PFGE was used to analyze Strain homology.Results The resistance rate of 60 strains to antibiotics in the top 3 were Cefoxitin （100.0%），Ceftazidime （90.0%），Atreonam （90.0%） and Polymyxin B was the lowest （5.0%）.The positive rate of modified Hodge test and EDTA synergy test were respectively 76.7% and 81.7%，and 39 strains of carbapenem gene were detected in the 60 strains，and 3 strains with KPC-2，24 strains with IMP-4，12 strains with IMP-8，45 strains with other β-lactamase gene；60 strains were divided into A-O by PFGE， 20 different types of 59 strains and only 1 strain was not successful in type.Conclusion The resistance mechanism of Enterobacter cloacae are mainly with KPC and IMP gene.

[Key words]Carbapenem；Enterobacter cloacae；Resistance mechanism；Homology陰溝腸桿菌廣泛存在于土壤、水等外界環境和腸道中，是腸道正常菌種之一，亦是臨床上常見的感染病原體。臨床研究表明，其可導致皮膚和軟組織、下呼吸道、尿路、傷口及中樞神經系統感染[1]。由于陰溝腸桿菌對多種抗菌藥物耐藥，因而臨床治療難度較大。其耐藥機制主要為可產生超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）和高產頭孢菌素酶（AmpC酶）[2]。碳青霉烯類抗生素對產AmpC和ESBL的革蘭陰性桿菌具有很好的治療效果，是治療多重耐藥腸桿菌感染的最后選擇[3-4]。近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的大量甚至過度使用，開始出現新型耐藥菌，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌逐漸增加，給臨床抗感染治療帶來嚴重挑戰。本研究探討碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的耐藥機制，旨在為陰溝腸桿菌感染的臨床治療提供參考。現報道如下。

1材料與方法

1.1 材料

收集2014年10月～2016年3月南昌仁愛婦產醫院、南昌大學第二附屬醫院、撫州市第一人民醫院檢驗科分離出的60株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌，剔除同一患者重復送檢相同標本及同一部位的重復菌株。全部菌株中分離于痰液8例，尿液6例，血液標本5例，胸腔積液2例， 膿液25例，導管液14例。采用法國梅里埃生物公司生產的VITEK-2型全自動微生物分析鑒定菌株。質控菌株采用大腸埃希菌ATCC25922。

1.2方法

1.2.1藥敏實驗 藥敏紙片包括頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢唑林、呋喃妥因、環丙沙星、慶大霉素、美洛培南、氨曲南、復方新諾明、左氧氟沙星、多黏菌素B、亞胺培南，由英國Oxoid公司提供；厄他培南（ETP）、亞胺培南（MP）E-test條由瑞典AB BIODISK公司提供。采用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗，測定抗菌藥物對菌株的MIC。參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI） 2012版[5]判定結果。

1.2.2改良Hodge試驗 采用直接菌落懸液法制備0.5麥氏濁度單位的大腸埃希菌ATCC25922菌液，以氯化鈉溶液稀釋10倍后在MH瓊脂平板上涂抹均勻，晾干后將美羅培南紙片（10 μg/片）貼于中部，以接種環挑取待測菌菌落，于平板邊緣向外劃直線，37℃下培養過夜。MHT陽性：美羅培南抑菌圈處出現向內生長，表明該菌株產碳青霉烯酶[6-7]。

1.2.3 EDTA協同試驗 采用K-B法將新鮮待測菌0.5麥氏濁度均勻涂布于MH瓊脂平板，亞胺培南紙片（30 μg/片）貼于中間，同時在紙旁張貼1張無菌白紙，兩紙片邊緣間距需為12～15 mm，將10 μl 0.5 mol/L 的EDTA 溶液滴于白紙上，37℃下培養過夜。協同試驗陽性：含EDTA白紙方向亞胺培南抑菌圈擴大，表明該菌株產ESBLs[8-9]。

1.2.4耐藥基因PCR檢測 制備檢測基因模板。以實驗菌株、受體菌株DNA、接合菌株中提取的質粒、標準菌株大腸埃希菌DNA為模板進行PCR反應。碳青霉烯酶基因的檢測采用PCR擴增法，具體條件如下。模板：2 μl，體系：F 1 μl、R 1 μl，ddH2O 9 μl，dNTPs 11.5 μl，Tag酶0.5 μl；循環參數設定如下：94℃預變性5 min，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，循環30次后72℃延伸10 min。提純獲取的基因陽性菌株PCR擴增產物，雙向測序下與已知序列對比，確定基因型。

1.2.5菌株同源性分析 菌株同源性檢測采用脈沖場凝膠電泳（PFGE），以Bionumerics軟件分析對PFGE電泳圖譜條帶的相似系數進行分析，相似比85%及以上為同一菌株的不同克隆亞型[10-11]。

2 結果

2.1藥敏試驗結果

60株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌對抗菌藥物的耐藥率前3位依次為：頭孢西丁（100.0%）、頭孢他啶（90.0%）、氨曲南（90.0%），多黏菌素B耐藥率最低（5.0%）（表1）。

2.2改良Hodge試驗及EDTA協同試驗結果

60株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌中改良Hodge試驗陽性46例，陽性率為76.7%；EDTA協同試驗發現49株（81.7%）產ESBLs。

2.3 耐藥基因檢測結果

60株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌中檢出碳青霉烯酶基因39株，其中KPC-2 3株，IMP-4 24株，IMP-8 12株，攜帶其他β-內酰胺酶基因45株。

2.4同源性分析

60株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌經PFGE分為A-O 20種不同的型別59株，僅有1株多次分型均未成功。

3 討論

近年來，隨著廣譜抗生素的普遍應用，細菌耐藥引起全球醫學界的關注。陰溝腸桿菌是社區及醫院感染的引起感染的革蘭陰性桿菌，可導致多部位及多器官感染。目前臨床上出現越來越多的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌，誘發難治性感染，因此，研究碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的耐藥機制以為陰溝腸桿菌感染的臨床治療提供參考具有重要意義。

本研究得到大多數陰溝腸桿菌屬于多重耐藥菌，且對抗生素的耐藥水平很高。全部菌株對抗菌藥物的耐藥率前3位依次為：頭孢西丁（100.0%）、頭孢他啶（90.0%）、氨曲南（90.0%），提示上述三種抗生素對陰溝腸桿菌幾乎無作用，其原因可能與過度使用有關，提示臨床上應酌情使用頭孢西丁、頭孢他啶及氨曲南。另外，60株陰溝腸桿菌對多黏菌素B耐藥率僅為5.0%，表明其對治療陰溝腸桿菌有效，但多黏菌素B具有高毒性，因而臨床應用受限。與此同時，本研究結果顯示，陰溝腸桿菌對亞胺培南的耐藥率（56.7%）高于美羅培南（36.7%），原因為亞胺培南的抗菌作用靶位為PBP2，而美羅培南的抗菌作用靶位包括PBP3和PBP2[12]。改良Hodge試驗陽性率為76.7%，出現假陽性的作用機制為細菌外膜蛋白、AmpC酶缺失或菌株攜帶且高表達ESBL[13]。受試陰溝腸桿菌中檢測出KPC、IMP基因，提示陰溝腸桿菌耐藥機制主要與KPC、IMP基因有關，與既往研究[14-15]一致。KPC酶屬于Ambler分類的A類絲氨酸β內酰胺酶，可在多數腸桿菌科細菌中被發現。其與SME碳青霉烯酶有45%的氨基酸同源性，可通過質粒介導產生耐藥。IMP酶多與aac、qnrS、AmpC、ESBLs及膜孔蛋白缺失共同作用導致耐藥。溝腸桿菌中主要的IMP酶包括IMP-8、IMP-4、IMP-1。耐藥基因同源性分析得到60株菌株經被分為 20種不同的型別，提示上述菌株來源于不同個體，敏感性細菌可能接受耐藥菌株水平傳播的耐藥基因。

綜上所述，碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌耐藥機制復雜，主要與KPC、IMP基因有關，院內感染應多關注該類菌株的傳播。為避免陰溝腸桿菌的播散和耐藥譜的擴大，應建立檢測體系，為陰溝腸桿菌的預防和控制提供參考依據。

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（收稿日期：2016-11-14 本文編輯：許俊琴）