動態顯色基質法測定地佐辛注射液中細菌內毒素的含量

石晶萍，黃加秀

（揚子江藥業集團有限公司，江蘇 泰州 225321）

動態顯色基質法測定地佐辛注射液中細菌內毒素的含量

石晶萍，黃加秀

（揚子江藥業集團有限公司，江蘇 泰州 225321）

目的：采用動態顯色基質法測定地佐辛注射液中的細菌內毒素含量。方法：根據《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部通則1143細菌內毒素檢查法，對樣品進行干擾預實驗和干擾實驗，確定樣品的最小不干擾濃度。結果：地佐辛注射液可采用稀釋200倍的溶液進行定量檢測。結論：動態顯色基質法可用于檢測地佐辛注射液中的細菌內毒素含量。

地佐辛注射液；動態顯色基質法；細菌內毒素；含量測定

地佐辛注射液為我公司生產的阿片類受體激動-拮抗劑，屬于苯嗎啡烷類衍生物，它是一種起效迅速、能緩解術后疼痛的強效鎮痛藥物，其鎮痛強度和持續時間同嗎啡的效果相當，但其成癮性小[1-3]，在臨床中被廣泛應用。為了保證其質量，避免臨床使用過程中熱原反應的發生，需嚴格控制樣品中的細菌內毒素含量，細菌內毒素檢查法是檢測供試品中細菌內毒素限量的方法，主要分為凝膠法和光度測定法，后者包含濁度法和顯色基質法[4-5]，本文采用動態顯色基質法對地佐辛注射液細菌內毒素含量檢測進行定量研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品地佐辛注射液，規格1 mL：5 mg（批號：14060541、14060641、14060941）以上樣品均由揚子江藥業集團有限公司生產。

1.1.2 試劑細菌內毒素工作標準品（WSE），效價80 EU/支（批號：150601-201681），由中國食品藥品檢定研究院提供。細菌內毒素檢查用水（BET水），50 mL/瓶（批號：1603310），由湛江安度斯生物有限公司提供。鱟試劑，規格50-0.005EU/mL，裝量1.25 mL/支（批號：1412110），由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.1.3 儀器LKL064-03型動態試管儀（湛江安度斯生物有限公司），檢測波長405 nm；ZH-2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；FED400烘箱（賓德）。

1.1.4 材料光度法檢測用反應管（規格：8×75 mm），由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌內毒素限值的確定細菌內毒素限值L ＝K/M，本品為注射劑、說明書規定的臨床最大劑量為20 mg，其K＝5 EU/（kg·h），則M＝20 mg/60（kg·h）；根據公式計算限值L＝K/M＝15 EU/mg，企業出于安全考慮為了更嚴格控制細菌內毒素，故將地佐辛注射液限值L定為7.5 EU/mg[6]。

1.2.2 鱟試劑靈敏度復核按《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部附錄細菌內毒素檢查法[7]鱟試劑靈敏度復核試驗項下規定進行，結果均符合規定。

1.2.3 標準曲線的可靠性試驗取BET水，將細菌內毒素工作標準品進行溶解稀釋，最終得到細菌內毒素標準品濃度分別為5.0，0.5，0.05，0.005 EU/mL的標準品溶液，每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30 s。各取0.1 mL分別加到預先加有0.1 mL鱟試劑的反應管內，混合均勻，立即插入LKL064-03型動態試管儀中。溫度為（37±1）℃，每一個濃度重復3管，并以BET水作空白對照。見表1。

表1 標準曲線的可靠性試驗結果

將數據進行線形回歸分析，得回歸性方程：

平行管的CV均＜10%，空白對照在規定檢測時間外，相關系數∣r∣＝0.999 1＞0.980，故標準曲線可靠。

1.2.4 最小有效稀釋濃度（C）的確定供試品的C計算方式如下：

式中L為細菌內毒素限值7.5 EU/mg，λ為標準曲線細菌內毒素最低濃度0.005 EU/mL。則得出供試品的C為0.000 667 mg/mL（供試液初始濃度5 mg/mL即最大可稀釋7 500倍）。

1.2.5 干擾試驗初篩實驗取供試品一瓶，用BET水分別稀至0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg/mL（分別稀釋50，100，200，400倍）作為供試品溶液。同時進行同樣稀釋倍數的稀釋，其中添加中點濃度即0.5 EU/mL的細菌內毒素對照品溶液作為供試品陽性對照液。

取上述制備的各溶液0.1 mL至含0.1 mL鱟試劑（50-0.005 EU/mL，用BET水復溶混合）的光度法檢測用試管中，每個濃度重復2管。進行自動檢測。同時以BET水作為陰性對照。見表2。

標準曲線：

變異系數在10%以下，相關系數∣r∣＝0.999 1＞0.980；空白對照在規定檢測時間外；為了今后在日常檢測中回收率能維持一個較好的水平，初步選擇稀釋倍數為200倍、回收率在100%左右的供試液做正式干擾試驗。

表2 干擾試驗初篩實驗結果

1.2.6 干擾試驗取三批供試品（批號：14060541，14060641，14060941），分別稀釋至200倍作為供試品溶液（即濃度為0.025 mg/mL）。見表3。

標準曲線：

LgTg＝2.682 5－0.278 2 LgC，

CV均在10%以下，相關系數∣r∣＝0.998 7＞0.980，空白對照在規定檢測時間外；回收率為50%～200%，說明供試品在稀釋至200倍（即濃度為0.025 mg/mL時）下，對鱟試劑與內毒素的反應無干擾。

1.2.7 樣品檢驗結果分別采用上述凝膠法和動態顯色基質法對三批樣品進行細菌內毒素含量測定。見表4。

表3 三個不同批次樣品的干擾試驗結果

表4 三批樣品檢測結果

上述表格中三批樣品光度法結果：供試品原液內毒素含量＜0.100 0 EU/mL，原液規格為1 mL∶5 mg，則轉換為＜0.2 EU/mg，均符合標準規定。說明該方法可用于日常監測。

2 討論

細菌內毒素檢查法是用鱟試劑與細菌內毒素產生凝聚反應的機制，以判斷供試品中細菌內毒素是否符合規定的一種方法。該法與熱原法比較具有靈敏度高、重現性好、標準化實驗過程短，且可完成多批次供試品檢測等優點[8]。動態顯色基質法可以測出產品中細菌內毒素含量[9]，可以更真實更客觀反應藥品的內在質量。因此可以采用動態顯色基質法，監控產品中細菌內毒素的具體含量，確保地佐辛注射液制劑的細菌內毒素水平在安全范圍內。

[1] 刑剛.地佐辛治療輸尿管結石性腎絞痛的效果分析[J].臨床醫學研究與實踐,2016,1(15):31-32.

[2] 潘英麗.用地佐辛和曲馬多對剖宮產術中出現寒戰癥狀的產婦進行治療的效果對比[J].當代醫藥論叢,2016,14(17):33-34.

[3] 郭鳳林,柴小青.右美托咪定地佐辛單獨或聯合用藥對腔鏡下胃癌根治患者術后蘇醒期的影響[J].安徽醫學,2016,37(9):1075-1078.

[4] 彭燕,張玲莉,王宗春.顯色基質法檢測乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液細菌內毒素含量[J].中國藥師,2013,16(10):1597-1599.

[5] 曾云勝,張玲莉,彭燕.顯色基質法檢測乳酸環丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素[J].中國醫藥導報,2015,12(18):92-95.

[6] 朱佳麗,段鵬,曹慧,等.動態濁度法定量測定碘克沙醇中細菌內毒素的含量[J].中國藥師,2016,19(2):384-387.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版)四部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:154-157.

[8] 王璐,張紅宇. 劉勤凝膠法和光度法測定燈盞花素注射液中細菌內毒素的含量[J].昆明醫學院學報,2010,31(2):39-43.

[9] 馬平,馬國榮,吳菊壽,等.凝膠法和動態濁度法在b型流感嗜血桿菌結合疫苗細菌內毒素控制中的應用比較[J].中國醫藥指南,2013,11(34):17-19.

本文編輯：蘇日力嘎

Determination of Bacterial Endotoxin Content in Dezocine Injection by Kinetic Chromogenic Substrate Method

Shi Jing-ping, Huang Jia-xiu
（Yangtze River Pharmaceutical Group Co., Ltd., Jiansu Taizhou 225321, China）

Objective：To determine the bacterial endotoxin content in dezocine injection by dynamic chromogenic substrate method.Methods：According to the requirements in Bacterial Endotoxin Test in the Chinese Pharmacopoeia (Volume Ⅳ, 2015 edition), pre-interference and interference tests were perforemd to determine the minimum sample concentration without interference.Results：Dezocine injection may be quantitatively determined after being diluted 200 folds.Conclusion：Dynamic chromogenic substrate method may be used for the determination of bacterial endotoxin content in dezocine injection.

Dezocine Injection; Kinetic Chromogenic Substrate Method; Bacterial Endotoxin; Content Determination

R927.12

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.008

2016 - 09 - 25

石晶萍，女，副主任藥師。研究方向：藥品檢驗與質量管理。通訊作者E-mail：sjp@yangzijiang.com