111株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST基因分型研究

劉德華，胡大春，保靜菲，古文鵬，姚為群

（1．昆明醫科大學附屬甘美醫院檢驗科，云南省昆明市臨床疾病分子生物學重點實驗室，云南 昆明 650011；2．云南省疾病預防控制中心，云南 昆明 650211；3．昆明醫科大學附屬甘美醫院感染科，云南 昆明 650011）

111株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST基因分型研究

劉德華1，胡大春1，保靜菲1，古文鵬2，姚為群3

（1．昆明醫科大學附屬甘美醫院檢驗科，云南省昆明市臨床疾病分子生物學重點實驗室，云南 昆明 650011；2．云南省疾病預防控制中心，云南 昆明 650211；3．昆明醫科大學附屬甘美醫院感染科，云南 昆明 650011）

目的：回顧性調查昆明醫科大學附屬甘美醫院2010年10月 - 2013年12月分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株的多位點序列分型（MLST）基因分型狀況及流行趨勢，為防控MRSA暴發提供數據資料。方法：收集昆明醫科大學附屬甘美醫院2010年10月 - 2013年12月連續分離的非重復MRSA 111株，通過MLST分析獲得7個管家基因的等位基因譜，提交至MLST網站確定序列型（ST），進一步結合病歷資料獲取科別及時間段的集中流行趨勢。結果：111株MRSA經MLST分析得到11個 ST序列型，發現其中104株細菌集中在ST239、ST5、ST7和ST15型別，尤其是ST239和ST5型。ST239共有43株，且86.05%（37/43）集中于2010年10月 - 2011年2月，主要出現在呼吸科、神經外科、ICU和乳腺科4個科室；ST5共有42株，且80.95%（34/43）集中于2013年7 - 10月，主要出現在呼吸科、神經外科、ICU、干療科和乳腺科5個科室；ST7為11株；ST15為8株；ST641、ST6、ST9、ST59、ST965、ST88、ST217各1株。結論：昆明醫科大學附屬甘美醫院MRSA的ST型別多樣化，但主要流行克隆系為ST239和ST5，ST7、ST15、ST464、ST6、ST9、ST59、ST965、ST88、ST217等克隆系也有分布。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；多位點序列分型；基因分型；流行趨勢

MRSA是世界范圍內引起醫院內感染的重要病原菌[1]，且具有多重耐藥性，又易引起感染的暴發和流行。本文茲對昆明醫科大學附屬甘美醫院近年來收集的111株MRSA進行MLST流行病學調查，以了解MRSA的分子特征及醫院內感染的暴發，從而為今后控制MRSA的感染以及暴發提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集2010年10月 - 2013年12月昆明醫科大學附屬甘美醫院臨床標本中分離的MRSA共111株，所有菌株均為同一時間內連續分離的非重復株，同一患者只取第一次分離株。分離鑒定后的菌株于-40℃冰箱保存。111株MRSA中67株來源于深部痰液及肺泡灌洗液，占60.36%；分泌物（包括創面分泌物、膿液、穿刺液等）28株，占25.23%；導管尖端5株，占4.5%；胸腹水4株，占3.6%；尿液3株，占2.7%；血液3株，占2.7%；腦脊液1株，占0.9%。MRSA主要分離自呼吸內科、ICU、神經外科、乳腺科、干療科及其他科室。呼吸內科和ICU MRSA共計50株，占總分離株的45.05%。質控菌株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC43300，由衛生部臨床檢驗中心贈送。

1.1.2 主要儀器低溫超速離心機（Heraeus公司），PCR擴增儀（MyCyclery，Bio-Rad公司），電泳儀（Power PAC 3000，Bio-rad公司），凝膠成像分析系統（Gel Doc 2000 TM，Bio-rad公司）。

1.1.3 試劑Lysostaphin（SD9001）（TaKaRa，日本）；TaqDNA聚合酶、MgCl2及dNTP（Promega，美國，TaKaRa，日本）。PCR引物合成及MLST產物測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取取血平板上分純后新鮮過夜6～8個單個菌落，混懸于0.3 mL含有50 U/mL Lysostaphin的TE中（pH＝8.0），35℃水浴30 min，95℃煮沸10 min，15 000 rpm離心20 sec后取上清即為細菌總DNA溶液，測OD值檢測DNA含量。

1.2.2 MLST分型反應體系為50 μL。7個管家基因（arcc，aroe，glp，gmk，pta，tpi，yqil）PCR所用的引物參照文獻[2]，引物arcc up-5’ TTG ATT CAC CAG CGC GTA TTG TC-3’,arcc dn-5’ AGG TAT CTG CTT CAA TCA GCG-3’; aroe up-5’ ATC GGA AAT CCT ATT TCA CAT TC-3’,aroe dn-5’ GGT GTT GTA TTA ATA ACG ATA TC-3’; glp up-5’ CTA GGA ACT GCA ATC TTA ATC C-3’,glp dn-5’ TGG TAA AAT CGC ATG TCC AAT TC-3’; gmk up-5’ ATC GTT TTA TCG GGA CCA TC-3’,gmk dn-5’ TCA TTA ACT ACA ACG TAA TCG TA-3’; pta up-5’ GTT AAA ATC GTA TTA CCT GAA GG-3’,pta dn-5’ GAC CCT TTT GTT GAA AAG CTT AA-3’; tpi up-5’ TCG TTC ATT CTG AAC GTC GTG AA-3’,tpi dn-5’ TTT GCA CCT TCT AAC AAT TGT AC-3’; yqil up-5’ CAG CAT ACA GGA CAC CTA TTG GC-3’,yqil dn-5’ CGT TGA GGA ATC GAT ACT GGA AC-3’。PCR反應條件：95℃預變性5 min，然后94℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min循環35次，后72℃延伸5 min。片段大小從402～516 bp不等。PCR產物純化后進行雙向測序。

1.2.3 MLST數據處理及分析將上述測序產物上傳MLST網站（http://www.mlst.net/）的金黃色葡萄球菌數據庫（http://saureus.mlst.net/）中的Locus Query下的Single locus進行7個等位基因數據的分析，得出7個等位基因號；通過數據庫中Prof le Query下的Allelic對7個等位基因號進行分析，得到每株菌的ST型別。

1.2.4 對相同ST型別結合病歷資料獲取分布科別及時間段的集中流行趨勢。

2 結果

111株MRSA進行MLST檢測，其PCR產物電泳結果舉例見圖1。

111株MRSA進行MLST檢測，其測序結果舉例見圖2。

111株MRSA的MLST共有11種分型，結果見表1。

根據MLST結果及菌株分離的時間和科別進行分析，111株MRSA的流行時間分布情況見圖3；科別分布情況見圖4。

圖1 MRSA的MLST檢測PCR擴增產物電泳

圖2 MRSA的MLST測序

表1 111株MRSA的MLST結果

圖3 111株MRSA各型別的流行時間分布

圖4 111株MRSA各型別的科別分布

3 討論

常用的MRSA菌株分子流行病學分型方法包括脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型、MLST、SCCmec分型和spa分型等。PFGE方法依據脈沖電泳條帶的差異進行分型，雖分辨率高被認為是分型的金標準，但其難以將分型結果數字化，不利于不同實驗室之間分型結果的比較[3]。本研究采用的MLST方法是目前MRSA分型的主要方法，分型的結果都很容易數字化，方便構建標準的開放數據庫網站，有利于不同地區的分子流行病學數據比較。其技術在實驗過程的可操作性及實驗結果的可靠性之間取得了平衡，同時該方法簡便快捷、重復性強、分辨率高[4-5]。

本研究發現，其中104株細菌集中在ST239、ST5、ST7和ST15型別中，尤其是ST239和ST5型。ST239克隆株在巴西首次被發現，此后在世界各地廣泛流行[6]，是引起亞洲院內感染的主要克隆株，約90%MRSA的感染是由ST239克隆引起的[7]。從流行病學角度來看主要和近年報道的醫院獲得性流行菌株（HA-MRSA）分型一致。本研究中ST239共有43株，主要出現在呼吸科、神經外科、ICU和乳腺科4個科室；ST5共有42株，主要出現在呼吸科、神經外科、ICU、干療科和乳腺科5個科室。而近年來國內報道的MRSA流行也多以HA-MRSA為主，國內多家醫院收集菌株的流行病學調查發現以ST239和ST5代表的HA-MRSA在院內廣泛流行[8]。王艷海等[9]報道的鄂爾多斯地區蒙古族人群耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST基因分型結果也一致；據朱佩瓊等[10]報道浙江省內流行最廣的主要有ST239、ST5和ST59型，同時這些克隆型的耐藥性也普遍較高；楊永剛等[11]報道杭州地區耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST檢測共發現9個ST型（以ST5為主，占59.3%；其次為ST239，占16.3%）；熊祝嘉等[12]調查中國7所教學醫院MRSA的流行和耐藥情況中，ST5型克隆的檢出率高達24.6%，僅次于ST239克隆的74.6%，已成為中國大陸以及其他亞洲地區第2位主要的MRSA流行克隆型，需引起高度重視。

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本文編輯：張鈺

Multilocus Sequence Typing of 111 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Strains

Liu De-hua1, Hu Da-chun1, Bao Jing-fei1, Gu Wen-peng2, Yao Wei-qun3
(1. Department of Laboratory Medicine, Calmette Hospital Aff liated to Kunming Medical University, Key Laboratory of Clinical molecular Biology of Kunming City, Yunnan Province, Yunnan Kunming 650011, China; 2. Yunnan Centre for Disease Control, Yunnan Kunming 650211, China; 3. Department of Infection, CalmetteHospital Aff liated to Kunming Medical University, Yunnan Kunming 650011,China)

Objective：To investigate the sultilocus sequence typing (MLST) and epidemic trend of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) strains isolated in Calmette Hospital Affiliated to Kunming Medical University from October 2010 to December 2013 retrospectively, and provide a basis for the prevention and control of MRSA outbreak.Methods：A total of 111 non-repetitive methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains were collected from October 2010 to December 2013 in the Calmette Hospital Aff liated to Kunming Medical University, from which seven housekeeping genes alleles were obtained by MLST and submitted to MLST webstite to determine the sequence type (ST), and the result was used for prediction of epidemic trend in combination with clinical data acquisition.Results：A total of 11 ST series were obtained from the 111 strains of MRSA by MLST. A portion of 104 strains belonged to ST239, ST5, ST7 and ST15, especially ST239 and ST5. Forty-three strains belonged to ST239, of which 37 (86. 05%) were found from October 2010 to February 2011, mainly in the department of respiratory diseases, department of neurosurgery, ICU and department of breast diseases. Forty-two strains belonged to ST5, of which 34 (80.95%) were found from July 2013 to October 2013, mainly in the departmentof respiratory diseases, department of neurosurgery, ICU, geriatrics and department of breast diseases. In addition, 11 strains belong to ST7, 8 to ST15 8, and one to each of ST641, ST6, ST9, ST59, ST965, ST88 and ST217.Conclusion：The ST of MRSA strains in Calmette Hospital showed diversity, of which the mainly popular clones were ST239 and ST5, and the distributions of ST7, ST15, ST464, ST6, ST9, ST59, ST965, ST88 and ST217 clones were also found.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA); Multilocus Sequence Typing (MLST); Genotyping; Epidemic Trends

R446.5

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.002

2016 - 07 - 30

云南省教育廳科學研究基金項目（項目編號：2015Y161）；云南省教育廳科學研究基金項目（項目編號：2010C097）；昆明市衛生科技人才培養項目暨“十百千”工程培養計劃[項目編號：SW（帶）-09]

劉德華，男，碩士，講師。研究方向：細菌耐藥機制及流行病學。通訊作者E-mail：liudehua12340244@sina.com.cn