基于UGT1A1酶介導的膽紅素代謝考察大黃素在肝微粒體體系中的肝毒性

汪祺 戴忠 張玉杰++馬雙成

[摘要]以膽紅素代謝過程中UGT1A1酶介導的膽紅素葡萄糖醛酸結合環節為切入點，通過考察待測物大黃素對該酶的抑制作用預測其肝毒性。以膽紅素為UGT1A1酶底物，于人肝微粒體、大鼠肝微粒體及人重組UGT1A1酶中加入不同濃度膽紅素及大黃素，分別以膽紅素的總代謝產物生成量對膽紅素底物濃度作圖，以米氏方程雙倒數法繪圖，并以不同曲線的斜率對應膽紅素底物濃度繪制slop圖計算表觀抑制常數Ki，考察其對膽紅素葡萄糖醛酸結合的抑制作用，預測其肝毒性有無及大小。結果顯示大黃素在3個體系中對UGT1A1酶均有中強抑制作用，且抑制類型均為競爭型抑制。HLM，RLM，rUGT1A1體系的Ki分別為（5400±0956），（10020±0611），（4850±0528），P均<005。同時發現，大黃素對于UGT1A1酶的抑制在大鼠及人之間無明顯種屬差異。大黃素可通過抑制UGT1A1酶活性導致膽紅素代謝異常，從而存在引發肝毒性的潛在危險。該試驗所建立的體外研究方法為中藥肝毒性藥物的篩選提供了新思路和新方法，對中藥安全性評價具有借鑒意義。

[關鍵詞]大黃素； 肝毒性； 代謝酶； 肝微粒體； 表觀抑制常數

Hepatotoxicity of emodin based on UGT1A1 enzymemediated

bilirubin in liver microsomes

WANG Qi1， DAI Zhong1， ZHANG Yujie2*， MA Shuangcheng1*

（1 National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China；

2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract]To study the hepatotoxicity of emodin based on bilirubin metabolism mediated by glucuronidation of UGT1A1 enzyme In this study， three different incubation systems were established by using RLM， HLM， and rUGT1A1， with bilirubin as the substrate Different concentrations of bilirubin and emodin were added in the incubation systems The double reciprocal Michaelis equation was drawn based on the total amount of bilirubin glucuronidation The apparent inhibition constant Ki was then calculated with the slope curve to predict the hepatotoxicity The results indicated that emodin had a significant inhibition to the UGT1A1 enzyme in all of the three systems， with Ki=5400±0956（P<005） in HLM system， Ki =10020±0611（P<005） in RLM system， Ki=4850±0528（P<005） in rUGT1A1 system Meanwhile， emodin had no significant difference between rat and human in terms of inhibition of UGT1A1 enzyme Emodin had a potential risk of the hepatotoxicity by inhibiting the UGT1A1 enzyme activity And the method established in this study provides a new thought and new method to evaluate hepatotoxicity and safety of traditional Chinese medicines

[Key words]emodin； hepatotoxicity； metabolic enzyme； human liver microsome； apparent inhibition constant

doi：10.4268/cjcmm20162321

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（uridine 5′diphosphate glucuronosyltransferases， UGTs）是人體中最重要的二相代謝酶，能催化具有羥基、巰基、胺基、羧基和稀醇基團的脂溶性藥物或內源性物質與尿苷5′二磷酸葡萄糖酸酸的結合，使其水溶性增加，從而隨尿與膽汁排出，防止內源和外源性物質在體內蓄積產生毒性[1]。UGT1A1是人體UGTs家族中非常重要的一員，能代謝內源性物質膽紅素和炔雌醇等[26]。膽紅素是人體內一種非常重要的內源性物質，是臨床上判定黃疸的重要依據，也是肝功能的重要指標和肝損害的重要生物標志物。膽紅素在體內主要由UGT1A1酶轉化為水溶性膽紅素葡萄糖醛酸結合物BMG1，BMG2，BDG，從肝細胞分泌至膽汁中消除[78]。若UGT1A1酶受到外源性藥物抑制，UCB無法轉化為BG或轉化減少，膽紅素代謝則出現障礙，繼而導致UCB在肝細胞和血液內蓄積，引發毒性。因此考察藥物對UGT1A1介導的膽紅素葡萄糖醛酸結合的影響將有助于預測該藥物對肝臟是否具有毒性及毒性大小。

近年來文獻報道[913]中藥及其制劑導致的肝損傷病例逐年增加，如何首烏及其制劑，患者往往出現膽紅素水平顯著升高等癥狀[14]。大黃素在何首烏中含量較高，且其廣泛存在于常用中藥材（如大黃，蘆薈，首烏藤，虎杖）中，因此本試驗選取大黃素為待測藥物，在前期試驗的基礎上[1516]，以表觀抑制常數Ki為評價指標，考察不同肝微粒體體系（人重組UGT1A1酶，人肝微粒體，大鼠肝微粒體）中大黃素對UGT1A1酶活性的影響，旨在排除由于單一酶系所處環境不同，及不同種屬間UGT1A1酶的差異，從而更加真實準確的預測大黃素肝毒性大小。

1材料

Waters AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色譜儀（美國，Waters公司）；Waters XevoTMQTOFMS質譜系統（美國，Waters公司）；METTLER TOLEDO AE240型電子天平（瑞士，梅特勒托利多公司）；節能型職能恒溫槽SDC6（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Thermo 17R型高速低溫離心機（日本，Thermo公司）。

人肝微粒體（HLM，50人混合），大鼠肝微粒體（RLM，雌雄混合），重組人UGT1A1酶（rUGT1A1）均購自美國BD Gentest公司；磷酸鉀（純度≥98%）、氯化鎂（純度≥98%）、抗壞血酸（純度≥98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥98%）均購自百靈威科技；葡萄糖二酸單內酯（純度≥98%）、丙甲菌素（純度≥98%）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，純度≥98%）、二甲基亞砜（DMSO，純度≥98%）均購自Sigma Aldrich公司；膽紅素（批號100077201206，純度993%），大黃素（批號110756201512，純度987%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸、鹽酸均為分析純（北京化學試劑廠），乙腈、甲醇均為色譜純（Fisher公司）。

2方法與結果

21UPLC條件

Acquity UPLC HSS C18色譜柱（21 mm×100 mm， 18 μm）；Acquity UPLC HSS C18VanGuard Precolumn預柱（21 mm×5 mm， 18 μm）；流動相乙腈（A）01%甲酸溶液（B），梯度洗脫，0～21 min，40%～75%A，21～42 min，75%～95%A，42～80 min，95%A，80～85 min，95%～40%A，85～125 min，40%A，流速04 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測波長450 nm；進樣量10 μL。

22UDPGA發生系統的制備

精密稱取氯化鎂、葡糖二酸單內酯、丙甲菌素、UDPGA適量，用TrisHCl緩沖液（稱取Tris 1211 g，加入去離子水800 mL，加濃鹽酸調pH至74，以去離子水定容至1 000 mL）使溶解，使含氯化鎂5 mmol·L-1，葡糖二酸單內酯5 mmol·L-1，丙甲菌素25 mg·L-1，UDPGA5 mmol·L-1，即得UDPGA發生系統。

23溶液的制備

231對照品溶液的制備分別精密稱取膽紅素、大黃素對照品適量，加DMSO溶解制成不同濃度系列溶液：膽紅素036～335 μmol·L-1，大黃素036～1165 μmol·L-1（HLM體系），036～1165 μmol·L-1（RLM體系），039～316 μmol·L-1（rUGT1A1體系）。

232樣品溶液的制備取凍存HLM（RLM，rUGT1A1）融化，使酶蛋白質量濃度均為05 g·L-1，加入底物膽紅素溶液及大黃素溶液，置37 ℃恒溫水浴預孵育3 min后加入新鮮配制的UDPGA發生系統溶液啟動反應。反應10 min（RLM體系為15 min）后立即加入600 μL冰乙腈甲醇（2∶1，含抗壞血酸濃度為200 μmol·L-1） 終止反應，沉淀蛋白，渦旋1 min，13 000 r·min-1（r=5 cm）離心25 min，取上清液即得。體系終體積為200 μL，DMSO總用量不超過1%。結果見圖1。

24方法學考察

241日內、日間精密度考察按232項制備樣品溶液，僅加入底物膽紅素，使含膽紅素濃度為05，5，50 μmol·L-1，按上述液相色譜條件測定膽紅素高、中、低3個濃度下底物膽紅素及代謝產物，每個濃度平行5份，日內及日間（連續5 d）進樣測定。RSD均小于50%，結果符合規定。

242回收率考察按232項制備樣品溶液，僅加入底物膽紅素，使含膽紅素濃度為05，5，50 μmol·L-1，按上述液相色譜條件測定膽紅素高、中、低3個濃度下回收率，每個濃度平行5份，回收率870%～115%，結果符合規定。

243標準曲線按232項制備樣品溶液，僅加入底物膽紅素，按上述液相條件測定膽紅素HLM體系中標準曲線。膽紅素線性范圍分別為：HLM體系中315×10-7～106×10-6 mol，Y=259×105X-3 3471（R2=0994），RLM體系中在565×10-7～892×10-6mol，Y=259×105X-2 3161（R2=0984），rUGT1A1體系中在389×10-7～164×10-6 mol，Y=259×105X-4 0121（R2=0996）。

25大黃素對UGT1A1酶活性的影響

按23所述方法，分別以膽紅素的總代謝產物生成量對膽紅素底物濃度作圖，以米氏方程雙倒數法作圖測定，橫坐標為底物膽紅素濃度的倒數（1/c），縱坐標為加入大黃素后膽紅素代謝反應速率的倒數（1/v）；加入不同濃度大黃素對應不同曲線，以不同曲線的斜率對膽紅素底物濃度繪制slop圖，求得抑制常數Ki；大黃素在HLM，RLM，rUGT1A1中對UGT1A1酶動力學參數的影響，及對UGT1A1酶的抑制情況見圖2。

數據結果采用SPSS Statistics 170統計軟件進行單因素方差分析（OneWay ANOVA），結果發現，大黃素在3個體系中，對UGT1A1酶均有中強抑制作用，且抑制類型均為競爭型抑制。HLM，RLM，rUGT1A1體系的Ki分別為（5400±0956），（10020±0611）（4850±0528），P均<005。同時不同體系間進行多重比較發現Ki無明顯差異。分析試驗結果發現，3個體系中，大黃素對于UGT1A1酶的Ki無統計學差異，表明大黃素對于UGT1A1酶的抑制在大鼠及人之間無明顯種屬差異。大黃素可通過抑制UGT1A1酶活性導致膽紅素代謝異常，從而存在引發肝毒性的潛在危險。

3討論

大黃素為蒽醌類成分，廣泛存在于廖科植物中，如大黃，何首烏，虎杖等，具有重要的藥理活性，廣泛的生物活性，在中成藥中的應用較為普遍[17]。有文獻報道[18]，大黃素在體內的主要代謝途徑為UGT代謝，無論在哪種（小鼠、大鼠、豚鼠、狗、人）肝微粒體酶作用下，大黃素都會迅速代謝并生成葡萄糖醛酸結合物，Ⅱ相代謝反應明顯快于I相代謝反應

并占主導地位。因此本課題以Ⅱ相代謝體系為研究對象，以膽紅素代謝過程中UGT1A1介導的膽紅素葡萄糖醛酸結合環節為切入點，從代謝酶角度考察大黃素肝毒性，試驗結果發現，大黃素對于不同種屬下UGT1A1酶有較強抑制作用，且在人及大鼠間無明顯種屬差異，提示大黃素具有潛在致肝毒性風險。本試驗為中藥肝毒性藥物的篩選提供了新思路和新方法，對中藥安全性評價具有借鑒意義。

[參考文獻]

[1]Scriver C R The metabolic & molecular bases of inherited disease[M] NewYork： McGrawHill，2001

[2]Bosma P J， Seppen J， Goldhoorn B， et al Bilirubin UDPglucuronosyltransferase 1 is the only relevant bilirubin glucuronidating isoform in man[J] J Biol Chem，1994，269（27）：17960

[3]Lepine J， Bernard O， Plante M， et al Specificity and regioselectivity of the conjugation of estradiol， estrone， and their catecholestrogen and methoxyestrogen metabolites by human uridine diphosphoglucuronosyltransferases expressed in endometrium[J]. J Clin Endocrinol Metab，2004，89（10）：5222

[4]Itaaho K， Mackenzie P I， Ikushiro S， et al The configuration of the 17hydroxy group variably influences the glucuronidation of betaestradiol and epiestradiol by human UDPglucuronosyltransferases[J] Drug Metab Dispos， 2008，36（11）：2307

[5]Watanabe Y， Nakajima M， Ohashi N， et al Glucuronidation of etoposide in human liver microsomes is specifically catalyzed by UDPglucuronosyltransferases 1A1[J] Drug Metab Dispos，2003，31（5）：589

[6]Wen Z， Tallman M N， Ali S Y， et al UDPglucuronosyltransferases 1A1 is the principal enzyme responsible for etoposide glucuronidation in human liver and intestinal microsomes： structural characterization of phenolic and alcoholic glucuronides of etoposide an estimation of enzyme kinetics[J] Drug Mebal Dispos， 2007，35（3）：371

[7]Vitek L，Ostrow J D Bilirubin chemistry and metabolism metabolism，harmful and protective aspects[J]Curr Pharm Des，2009，15（25）：2869

[8]Hoekstra L T，de Graaf W， Nibourg G A et alPhysiological and biochemical basis of clinical liver function tests：a review[J].Ann Srug，2013，257（1）：27

[9]劉芳，李波藥物引起肝臟損傷的評價與檢測[J]藥物分析雜志， 2010，30（10）：1981

[10]方紅玫，朱延焱. 何首烏有效成分、毒性作用和相關研究進展[J]. 國際藥學研究雜志，2010，37（4）：283

[11]Hinshaw L BSepsis/septic shock： participation of the microcirculation： an abbreviated review[J] Crit Care Med，1996（6）：1072

[12]路璐，王勤英藥物性肝損傷143例臨床分析[J]中國醫藥，2016，11（6）：833

[13]Kyoung Ah Jung， Hyun Ju Min， Seung Suk Yoo， et al Druginduced liver injury： twenty five cases of acute hepatitis following ingestion of Polygonum multiflorum Thunb [J] Gut Liver，2011，5（4）：493

[14]鄢良春，趙軍寧，邱雄何首烏安全性問題研究進展[J]中藥藥理與臨床，2009，25（3）：77

[15]汪祺，張玉杰， 戴忠， 等微粒體體系中膽紅素及其代謝產物測定方法的建立[J] 藥物分析雜志，2015，35（9）：37

[16]汪祺， 戴忠， 張玉杰，等基于二相代謝酶介導膽紅素代謝考察不同體系UGT1A1酶動力學參數[J]中國藥學雜志，2015（19）：56

[17]蔡進章，林崇良，王賢親，等6種蓼科植物藥材大黃素含量比較[J]中華中醫藥學刊，2012，30（6）：1372

[18]劉薇大黃素肝腸代謝特征及性別差異研究[D]廣州：南方醫科大學，2010

[責任編輯曹陽陽]