稀土元素鑭對丹參活性物質(zhì)積累及其合成途徑中酶基因表達的影響

邊麗華+++鄒琳++周冰謙 劉偉 周潔

[摘要]該文研究了鑭對丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累及其合成途徑中酶基因表達的影響，為揭示土壤因子鑭影響丹參藥材品質(zhì)形成的環(huán)境機制奠定基礎(chǔ)。采用HPLC測定丹參毛狀根中活性物質(zhì)含量；采用Tiangen多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用PCR熒光定量試劑盒進行實時定量分析，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示鑭處理對丹參毛狀根內(nèi)丹參酮類和酚酸類的積累表現(xiàn)出顯著的促進效應，處理后9 d其酚酸類成分含量達到峰值，丹參酮類成分含量隨處理時間的延長而增加（15 d內(nèi)）；鑭處理后丹參體內(nèi)活性物質(zhì)積累的峰值時間相對滯后于酶基因表達的峰值時期，F(xiàn)PPS，TAT，HPPR 3個酶基因與丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量變化趨勢相似，暗示FPPS，TAT，HPPR 3個酶基因在鑭誘導的丹參活性物質(zhì)積累中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]丹參； 毛狀根； 活性物質(zhì)； 關(guān)鍵酶基因

Effect of Lanthanum on accumulation of active constituent and key enzymes expression of Salvia miltiorrhiza hairy root

BIAN Lihua1，3， ZOU Lin1， ZHOU Bingqian1， LIU Wei1， ZHOU Jie1，2*， WANG Xiao1

（1Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology， Shandong Analysis and

Test Center， Ji′nan 250014， China；

2 School of Biological Science and Technology，University of Ji′nan， Ji′nan 250012， China；

3 Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）

[Abstract]The effect of Lanthanum on the accumulation of active constituent and key enzymes expression of Salvia miltiorrhiza hairy root were studied and furthermore signaling molecules mediating the synthesis of secondary metabolism was also defined in order to provide references for the reveal of synthesis mechanism of active constituent of S miltiorrhiza hairy root inducing by Lanthanum The content of active constituents were detected by HPLC RNA was extracted with RNA prep Pure RNA purification kit （Tiangen） The results shows that LaCl3 processing promoted the accumulation of tanshinones and phenolic acids in S miltiorrhiza hairy root The accumulation of phenolic acids reached the highest at 9 d after treatment， and tanshinones accumulation continued to increase in 15 days Accumulation of active substance in S miltiorrhiza may relate with FPPS， TAT， HPPR several key enzyme activation

[Key words]Salvia miltiorrhiza； hairy root； active substance； key enzymes

doi：10.4268/cjcmm20162309

道地藥材是人們傳統(tǒng)公認且來源于特定產(chǎn)地的名優(yōu)正品藥材，是中藥材的精髓所在，也是歷代醫(yī)家防病治病最有力的武器之一[1]。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效[2]，屬于我國常用大宗藥材，是臨床上治療心腦血管疾病的要藥之一[3]。道地藥材品質(zhì)的形成與生態(tài)環(huán)境關(guān)系密切[4]，而關(guān)于丹參道地藥材品質(zhì)形成的環(huán)境因子及其作用機制尚未深入研究。

土壤因子是重要的生態(tài)因子，也是影響藥材產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要因素[5]。稀土是由原子序數(shù)為57～71的鑭系元素以及與之性質(zhì)極為相似的鈧、釔共17種元素組成。鑭（La）是一種典型的稀土，地殼中鑭約為0001 83%，稀土能夠影響藥材中活性物質(zhì)的積累[6]。據(jù)報道山東丹參道地產(chǎn)區(qū)土壤中La達到27 mg·kg-1[7]，丹參中La超過843 mg·kg-1，遠高于水稻、玉米、大麥等作物[8]，推測土壤中的鑭元素是影響山東丹參道地藥材品質(zhì)形成的重要生態(tài)因子。預實驗發(fā)現(xiàn)La處理后丹參中活性物質(zhì)的含量發(fā)生顯著變化，而La影響丹參中活性物質(zhì)積累的機制尚未深入探討。本文擬以丹參毛狀根為試材，研究La處理對丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累及其生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達的影響，探討丹參中活性成分及其關(guān)鍵酶基因?qū)﹁|的響應特點，為揭示丹參道地藥材形成的環(huán)境機制奠定基礎(chǔ)。

1材料

采用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株Agrobacterium rhizogenes 15834處理丹參葉片獲得丹參毛狀根，將經(jīng)PCR鑒定的陽性株系置于67 V液體培養(yǎng)基[9]中培養(yǎng)。精確稱取05 g毛狀根接種于50 mL培養(yǎng)基，25 ℃，110～120 r·min-1搖床上避光培養(yǎng)。

2方法

21實驗處理

毛狀根繼代培養(yǎng)18 d后，在無菌條件下添加LaCl3使其終濃度達到001 mmol·L-1（濃度由預實驗得到），對照加等量滅菌水，每個處理6個重復，分別于處理后1，3，5，9，15 d取樣，取樣時將毛狀根取出后迅速吸干水分，每一取樣點取得的樣品分為2份，一份樣品用液氮迅速冷凍，置-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫糜诨虮磉_分析；另一份迅速超低溫冷凍干燥，用于丹參活性物質(zhì)含量測定。

22毛狀根中活性物質(zhì)含量測定

將干燥后的丹參毛狀根研磨過篩，70%乙醇提取，HPLC同時測定迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量[1013]，以乙腈（A）和水（02%乙酸）為流動相，乙腈5%為初始濃度，0～25 min，5%～35% A，25～26 min，35%～100% A。酚酸類成分檢測波長為270 nm，丹參酮類成分檢測波長為280 nm；柱溫25 ℃。

23毛狀根中活性物質(zhì)生物合成中關(guān)鍵酶基因表達分析

231毛狀根總RNA提取采用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen RNA prep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒）提取。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA純度和完整性；使用核酸蛋白分析儀（TY10 Biospecnano ZX21）檢測RNA濃度。

232實時熒光定量PCR引物序列見表1。采用TaKaRa試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，采用瓊脂糖凝膠法檢測cDNA，采用實時熒光定量PCR儀進行 PCR檢測。利用Pfaffi法計算目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率。計算公式為基因表達量=C（A-E）/D（F-B），C，D分別是目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率；A和E分別是對照樣品和待測樣品中目的基因的Ct；F，B分別是對照樣品和待測樣品中內(nèi)參基因的Ct。

24數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS 130軟件進行數(shù)據(jù)分析。

3結(jié)果與分析

31RNA提取與檢測結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA無蛋白質(zhì)污染，RNA完整無降解，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA要求。核酸蛋白分析儀檢測結(jié)果顯示A260/230，A260/280讀數(shù)均在18～21，RNA質(zhì)量濃度均在200 mg·L-1以上，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA要求。cDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且為單一條帶說明PCR產(chǎn)物特異性好，無明顯引物二聚體，符合Real time實驗要求。引物的特異性良好，各引物擴增效率均在適宜范圍之內(nèi)，符合Real time PCR實驗要求。

32LaCl3處理對丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累的影響

321LaCl3處理對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累的影響LaCl3處理后1 d二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量均顯著高于對照（P<005），處理后3 d其含量略有下降，處理后5～15 d其含量逐漸升高，均顯著高于對照（P<005），如二氫丹參酮含量5～15 d分別高出對照6623%（5 d，P<005），5345%（9 d，P<005），2618%（15 d，P<005）。二氫丹參酮、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的含量應對鑭的響應表現(xiàn)出較相似的變化趨勢。與對照相比LaCl3處理后丹參酮類成分變化趨勢總體表現(xiàn)為“升降升”的趨勢，見圖1。

322LaCl3處理對丹參毛狀根中酚酸類成分的影響LaCl3處理對迷迭香酸和丹酚酸B成分的積累表現(xiàn)出促進效應。LaCl3處理后5 d迷迭香酸迅速積累，其含量顯著高出對照2859%（P<001）；處理后9 d其含量達到峰值，顯著高出對照5626%（P<001）。和迷迭香酸的變化趨勢相似，LaCl3處理后5 d丹酚酸B含量迅速上升，顯著高出對照3567%（P<001），處理后9 d達到峰值，見圖2。

33LaCl3處理對丹參毛狀根中關(guān)鍵酶基因表達的影響

331LaCl3處理對丹參酮類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達的影響LaCl3處理對AACT和FPPS表達量的影響較為相似，處理后1 d其表達量迅速上升，分別高于對照4963%（P<005），27364%（P<005）；處理后9 d表達量均低于對照；處理后15 d其表達量分別高出對照19094%（P<005），5058%（P<005）。LaCl3處理對GPPS的表達表現(xiàn)出促進抑制促進抑制的波浪狀趨勢，其中處理后1，5 d為2個GPPS表達量的高峰，分別高出對照24910%（P<005），11366%（P<005）。LaCl3處理對丹參酮類成分生物合成途徑中AACT，F(xiàn)PPS，GPPS 3個關(guān)鍵酶基因的表達均表現(xiàn)出促進和抑制相互交替的波浪線趨勢，見圖3。

332LaCl3處理對酚酸類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達的影響LaCl3處理對丹參毛狀根酚酸類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達的影響見圖4。LaCl3處理1 d對PAL表達量未表現(xiàn)出顯著影響，處理后3，5 d PAL表達略低于對照組，處理后9 d PAL表達量顯著高出對照17875%（P<005）；LaCl3處理后1 d C4H表達量迅速增加，顯著高出對照9407%（P<005）。LaCl3處理對4CL的表達總體表現(xiàn)為促進效應；處理后1 d HPPR基因表達量高出對照組39199%（P<005），3 d仍顯著高于對照，處理后5 d和9 d HPPR表達量略低對于對照，15 d又出現(xiàn)回升，高出對照6091%（P<005）。LaCl3處理對酚酸類成分生物合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達表現(xiàn)出促進和抑制相互交替的波浪線趨勢。

34相關(guān)性分析

341丹參酮類成分含量及其合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達量的相關(guān)性分析丹參酮類成分含量及其合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達量的相關(guān)性分析見表2。AACT，F(xiàn)PPS呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0685（P<005）。FPPS表達量與二氫丹參酮和隱丹參酮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0716（P<005），0750（P<005）。LaCl3處理后，丹參酮ⅡA與隱丹參酮含量之間尚未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，其余活性成分之間均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)性（P<005）。

342酚酸類成分與關(guān)鍵酶基因相關(guān)性分析酚酸類成分和關(guān)鍵酶基因相關(guān)性分析結(jié)果見表3。相關(guān)性分析結(jié)果顯示迷迭香酸和丹酚酸B之間有極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0966（P<001）。

4討論

本文通過研究LaCl3處理后不同時間段丹參酮類和酚酸類積累及其相應的關(guān)鍵酶基因表達量的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)鑭處理對丹參中丹參酮和酚酸類成分的積累整體表現(xiàn)出促進的效應，其中丹參酮類成分含量隨處理時間的延長而增加（15 d內(nèi)），酚酸類成分含量在處理后9 d達到峰值后又回落。

鑭處理后丹參體內(nèi)活性物質(zhì)生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達量表現(xiàn)出明顯的變化。FPPS，TAT，HPPR 3個關(guān)鍵酶基因均呈促進抑制相互交替的波浪狀變化，該趨勢與丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量變化趨勢相似，且活性物質(zhì)積累的峰值時間相對滯后于關(guān)鍵酶基因表達的峰值時期，暗示FPPS，TAT，HPPR關(guān)鍵酶基因在鑭處理誘導丹參中活性物質(zhì)丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B成分積累中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道FPPS是丹參酮類成分代謝途徑中的下游基因，其對丹參酮類成分合成影響作用較大。TAT是酪氨酸代謝途徑的起始酶，也被公認為是該途徑的限速酶[14]。HPPR為酪氨酸代謝途徑中第一個使代謝流特異流向迷迭香酸的關(guān)鍵酶[15]。3個酶基因均為代謝途徑中與次生代謝產(chǎn)物合成密切相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，與本實驗結(jié)果相吻合。相關(guān)性結(jié)果表明FPPS與二氫丹參酮和隱丹參酮均有顯著正相關(guān)，且鑭處理后1 d FPPS表達量即迅速上升，推測FPPS在鑭響應機制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。除了稀土元素外，土壤中影響藥用植物次生代謝產(chǎn)物積累的因子很多，從分子水平上探討其作用機制是揭示道地藥材品質(zhì)形成的環(huán)境機制的重要方面。

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[責任編輯呂冬梅]