miRNA21抑制物對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響

鄭鵬超,李磊

(荊門市第二人民醫(yī)院心胸外科，湖北 荊門 448000)

miRNA21抑制物對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響

鄭鵬超,李磊

(荊門市第二人民醫(yī)院心胸外科，湖北 荊門 448000)

目的：利用miRNA21抑制物抑制食管癌細(xì)胞系ECA-109中miRNA21的表達(dá)，觀察對(duì)ECA-109細(xì)胞凋亡的影響，為探討miRNA21抑制物在食管癌治療中的應(yīng)用提供理論參考。方法：以正常培養(yǎng)的ECA-109細(xì)胞為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物陰性對(duì)照物作為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物作為實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究miRNA21抑制物對(duì)ECA-109細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠顯著性地抑制ECA-109細(xì)胞的增殖 (P<0.05)，并且明顯提高ECA-109細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制劑的實(shí)驗(yàn)組ECA-109細(xì)胞中促凋亡基因caspase3、p53、在mRNA水平的表達(dá)均顯著升高 (P<0.05)，而抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)則被顯著抑制 (P<0.05)。結(jié)論：miRNA21抑制劑能夠抑制食管癌細(xì)胞ECA-109的增殖，增強(qiáng)促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡；miRNA21具有明顯的原癌基因樣功能，可作為食管癌細(xì)胞治療的靶標(biāo)。

食管癌；miRNA21；miRNA21抑制物；細(xì)胞凋亡

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類保守的非編碼RNA，其長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸，能夠與mRNA特異性性結(jié)合，介導(dǎo)靶基因mRNA的降解，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控[1-2]。目前，miRNA21是唯一被報(bào)道在多種實(shí)體腫瘤(如肺癌、乳腺癌、食管癌)中都呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)的miRNA，能夠參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3-5]。因此，探索miRNA21抑制物在癌細(xì)胞凋亡中的作用，能夠?yàn)榕R床癌癥治療提供重要的理論參考。本文以反義寡核苷酸作為miRNA21抑制物，轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系ECA-109，初步探討miRNA21抑制物對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

食管癌細(xì)胞系ECA-109 (中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；miRNA21抑制物和miRNA21抑制物陰性對(duì)照物 (上海艾博思生物公司)；DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑 (美國(guó)Thermo)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、臺(tái)盼藍(lán)、噻唑藍(lán) (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO)、青霉素、鏈霉素 (上海索萊寶生物公司)；TRIzol、cDNA快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR mixture試劑盒 (北京天跟生物公司)；imark全自動(dòng)酶標(biāo)儀、IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、S3全自動(dòng)化流式細(xì)胞儀 (美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 食管癌上皮細(xì)胞ECA-109為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，采用單層貼壁式培養(yǎng)。基礎(chǔ)培養(yǎng)液為RPMI1640，加入10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37 ℃培養(yǎng)箱 (5% CO2)恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前48 h，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，用六孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右。用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基將miRNA21抑制物及其陰性對(duì)照物稀釋至200 ng/mL，將二者分別與RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后的DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑 (1∶100稀釋) 等體積混合，室溫靜置5～10 min。將含miRNA21抑制物的混合液1 mL加入1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，作為實(shí)驗(yàn)組 (miRNA21 inhibitor)；將含miRNA21抑制物陰性對(duì)照物的混合液1 mL加入1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，作為陰性對(duì)照組 (miRNA21 inhibitor NC)；將1 mL不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基加入一個(gè)培養(yǎng)孔，作為空白對(duì)照組 (Blank)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化成單細(xì)胞懸液，取少量用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)。將細(xì)胞密度稀釋至1×104個(gè)/mL，并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；24 h后，按照上述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。每組于轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h分別取出一板用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增長(zhǎng)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)定3個(gè)平行孔。MTT法具體實(shí)驗(yàn)方法是：每孔加入25 μL MTT溶液(5 μg/μL)，置于37 ℃溫箱中孵育4～5 h，小心吸去上清液；每孔加入200 μL DMSO，輕搖至結(jié)晶沉淀物溶解；用imark全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)的吸光度值A(chǔ)；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照上述方法調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL，采用無(wú)血清培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞同步化處理；隨后，按上述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；72 h后，將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗滌2～3次，將細(xì)胞密度稀釋至1×106個(gè)/mL；置于4 ℃，用70%乙醇固定12 h以上；用5 mg/L溴乙錠染色20 min；用500目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 將進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)48 h的各組細(xì)胞收集 (每組收集3個(gè)培養(yǎng)孔)，用PBS洗滌2～3次，加入1 mL TRIzol試劑裂解細(xì)胞，并按照酚-氯仿抽提法提取細(xì)胞總RNA。參照天根生物科技公司的cDNA快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的使用說(shuō)明進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase3、p53、Bcl2基因的表達(dá)變化。所用引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；利用GrahPad Prism5.0繪制折線圖及柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 miRNA21抑制物對(duì)ECA-109細(xì)胞增殖的影響

利用MTT比色法繪制細(xì)胞增殖曲線，由圖1所示：在各測(cè)定時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞增值曲線相互重合，未產(chǎn)生明顯差異；而轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物則能夠顯著抑制ECA-109細(xì)胞的增殖 (P<0.05)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制效果增強(qiáng)；與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率為31%，72 h抑制率為53.7%，96 h抑制率為58.8%，120 h抑制率為59.2%。

2.2 miRNA21抑制物對(duì)ECA-109細(xì)胞凋亡的影響

表2所示為細(xì)胞凋亡率的變化。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中細(xì)胞的凋亡率分別為 (12.23±1.12)%、(13.18±0.98)%，二者無(wú)顯著性差異 (P>0.05)；轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為 (35.27±1.34)%，顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組 (P<0.05)。

組別細(xì)胞凋亡空白對(duì)照組12．23±1．12陰性對(duì)照組13．18±0．98抑制物35．27±1．34

注：凋亡率代表3次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)。

2.3 miRNA21抑制物對(duì)ECA-109細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

在細(xì)胞凋亡中，caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的終末剪切酶，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者；p53作為一種抗癌基因產(chǎn)物，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bcl-2作為一種原癌基因產(chǎn)物，能夠參與調(diào)控線粒體功能，阻斷p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6-8]。因此，我們通過(guò)檢測(cè)miRNA21抑制物對(duì)caspase-3、p53、Bcl-2基因的表達(dá)，探討miRNA21抑制物影響細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA21陰性對(duì)照物的陰性對(duì)照組細(xì)胞中caspase-3、p53、Bcl-2基因的表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性變化 (P>0.05)；而轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，促凋亡基因caspase-3、p53基因的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組 (P<0.05)，抗凋亡基因Bcl-2基因的表達(dá)則明顯降低 (P<0.05)。

3 討論

食管癌是最常見的消化道腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)區(qū)之一，每年有超過(guò)15萬(wàn)人死于食管癌。目前，食管癌的治療以手術(shù)治療為首要療法，但仍需配合化學(xué)治療、放射治療方能穩(wěn)定療效。然而，放射治療和化學(xué)治療所帶來(lái)的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，亟需開發(fā)新的食管癌質(zhì)量手段，以避免不良反應(yīng)、穩(wěn)定療效、提高治愈率。

miRNA作為重要的基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控因子，已被證明在多種癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡中都發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)功能[9]。目前，已有大量的研究證實(shí)miRNA-21在心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多種疾病中都具有重要的調(diào)節(jié)功能，參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、腫瘤血管生成和抗藥性形成等。在非小細(xì)胞肺癌、肝癌等癌組織中，miRNA21都有異常性的升高表達(dá)，循環(huán)中的miRNA21已被選擇多種癌癥早期檢測(cè)的標(biāo)志物[10-11]。在惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、舌鱗狀細(xì)胞癌中，miRNA21被證實(shí)能夠作為凋亡抑制因子，保護(hù)癌細(xì)胞免受化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12-13]。這些研究成果充分證實(shí)miRNA21在腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能，拮抗miRNA21抗細(xì)胞凋亡作用有可能成為癌癥治療的新靶點(diǎn)。

本研究利用miRNA21抑制物拮抗miRNA21的功能，對(duì)miRNA21抑制物在人食管癌細(xì)胞凋亡中的功能進(jìn)行了初步探討。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物48 h后，人食管癌細(xì)胞系ECA-109細(xì)胞增殖受到顯著性地抑制，并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，最高可達(dá)59.2% (轉(zhuǎn)染后120 h)；而轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物的陰性對(duì)照物則不對(duì)ECA-109細(xì)胞的增殖產(chǎn)生顯著影響。更重要的是，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠顯著提高ECA-109細(xì)胞的凋亡率。轉(zhuǎn)染72 h后，miRNA21抑制物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率可達(dá) (35.27±1.34)%，顯著高于陰性對(duì)照組的 (13.18±0.98)%。這些結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠有效地拮抗miRNA21抗細(xì)胞凋亡的作用，抑制食管癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miRNA21抑制物對(duì)幾種凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。有文獻(xiàn)研究證實(shí)miRNA21能夠通過(guò)影響B(tài)cl-2的表達(dá)、調(diào)節(jié)caspase-3和p53活性等方式參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[14-16]。本研究選擇caspase-3、p53和Bcl-2作為代表，檢測(cè)miRNA21抑制物對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA21抑制物能夠明顯地提高促凋亡基因caspase-3、p53基因在mRNA水平的表達(dá)，而抗凋亡基因Bcl-2在mRNA水平的表達(dá)則被顯著抑制。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miRNA21抑制物能夠拮抗miRNA21的功能，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。

本研究研究了miRNA21抑制物對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響，證實(shí)miRNA21抑制物能夠拮抗miRNA21的功能，調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞的增值，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。這些研究成果證實(shí)應(yīng)用miRNA21抑制物能夠作為臨床應(yīng)對(duì)食管癌的新療法，相應(yīng)的研究成果為miRNA21抑制物的臨床應(yīng)用提供了重要的理論參考。

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(學(xué)術(shù)編輯：李祖茂)

The influence of miRNA21 inhibitor on esophageal carcinoma cell apoptosis

ZHENG Peng-chao，LI Lei

(DepartmentofCardio-ThoracicSurgery,TheSecondPeople’sHospitalofJingmen,Jingmen448000,Hubei,China)

Objective：The purpose of this study was to provide theoretical reference for the application of miRNA21 inhibitor in the treatment of esophageal carcinoma,by using miRNA21 inhibitor miRNA21 expression in ECA-109 esophageal cancer cell lines,to observe the influence of the ECA-109 cell apoptosis.Methods：The cultured ECA-109 cells were divided into blank control group (normally cultured),negative control group transfected with negative miRNA21 inhibitor,and the experimental group transfected with miRNA21 inhibitor.The influence of miRNA21 inhibitor on cell proliferation,apoptosis and apoptosis-related gene expression of ECA-109 cells was repectively investigated by MTT method,flow cytometry and real-time fluorescence quantitative PCR.Results：Compared with blank and negative control groups,the transfection of miRNA21 inhibitor significantly inhibited the proliferation of ECA-109 cells (P<0.05),significantly elevated the percent of apoptotic cells (P<0.05) and promoted its apoptosis.While,the expression of pro-apoptotic genes as caspase3 and p53 was significantly elevated in ECA-109 cells of experimental group (P<0.05).However,anti-apoptotic gene Bcl-2 was significantly inhibited (P<0.05).Conclusion：miRNA21 inhibitors can inhibit the proliferation of esophageal cancer cell ECA-109,enhance the expression of pro-apoptotic genes and promote the apoptosis of esophageal carcinoma cells.Therefore,miRNA21 has the similar function of oncogene,which can be used as a target for the treatment of esophageal carcinoma cells.

Esophageal cancer;miRNA21;miRNA21 inhibitor;Apoptosis

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.022

2016-08-20

鄭鵬超(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail：1085209450@qq.com

時(shí)間：2017-3-6 21∶08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2108.044.html

1005-3697(2017)01-0078-04

R735.1

A