右美托咪定對炎癥性疼痛大鼠的超前鎮痛作用

文松，王捷，肖智，李瑛

(1.遵義醫學院附屬醫院麻醉科；2.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563099)

右美托咪定對炎癥性疼痛大鼠的超前鎮痛作用

文松1，王捷1，肖智2，李瑛1

(1.遵義醫學院附屬醫院麻醉科；2.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563099)

目的：觀察鞘內注射右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)對炎癥性疼痛大鼠的鎮痛作用以及對大鼠脊髓背角P物質(substance P，SP)表達的影響；明確DEX對炎癥性疼痛大鼠具有超前鎮痛效應。方法：建立福爾馬林誘導的炎癥性疼痛SD大鼠模型并給予鞘內注射DEX；觀察大鼠疼痛行為學變化；免疫組織化學法和免疫印跡法檢測大鼠脊髓背角(L4-6)SP陽性表達變化。結果：炎癥性疼痛大鼠疼痛行為學評分增加，脊髓背角SP陽性表達上調；給予鞘內注射DEX可降低炎癥性疼痛大鼠疼痛行為學評分以及脊髓背角SP陽性的表達(P均<0.001)；鞘內預注射DEX大鼠的疼痛行為學評分和脊髓背角SP表達低于DEX后處理組(P均<0.001)。結論：鞘內注射DEX通過抑制炎癥性疼痛大鼠脊髓背角SP表達產生鎮痛作用，該作用具有超前鎮痛效應。

右美托咪定；炎癥性疼痛；超前鎮痛；P物質

疼痛是組織損傷或潛在的組織損傷，或據此損傷所描述的一種不愉快的感覺和情感體驗。按照國際疼痛研究學會(international association for the study of pain，IASP)的分類，疼痛包括生理性疼痛和病理性疼痛，其中病理性疼痛可進一步分為炎癥性疼痛、神經病理性疼痛和癌性疼痛等。疼痛發生機制包括中樞敏化和外周敏化，進而使疼痛閾值下調，機體產生疼痛。脊髓背角在疼痛的中樞敏化機制中有重要作用，其機制包括神經元、神經膠質細胞功能的改變，神經遞質釋放及其受體表達變化等。P物質(substance P，SP)是經典的疼痛相關遞質，多篇文獻報道脊髓背角SP的改變介入炎癥性疼痛的形成和維持機制[1-2]。超前鎮痛是在疼痛發作之前進行的鎮痛，即減少任何傷害性刺激傳入中樞，從而防止或抑制中樞敏化和/或外周敏化的治療。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是α2-腎上腺素能受體激動劑，具有鎮靜、鎮痛、抗交感等作用[3]，廣泛運用于臨床麻醉和圍手術期鎮痛。本研究將觀察鞘內注射DEX對足底皮下注射福爾馬林引起的急性炎癥性疼痛大鼠是否具有鎮痛作用以及該作用是否具有超前鎮痛效應，同時探討其鎮痛機制中是否有脊髓背角SP水平的改變，本研究將為拓寬DEX的臨床鎮痛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康成年雄性SD大鼠90只(重慶第三軍醫大學動物實驗中心提供)，體重(250±10)g，實驗期間分籠飼養，3～4只大鼠1籠；大鼠置于安靜，溫度(25±1)℃，濕度(60±5)%，人工光照，明暗各12 h/d (8AM-8PM)周期環境中，自由進食，飲水。所有與動物飼養和操作的相關事宜都遵循IASP關于應用動物進行疼痛研究的倫理綱要進行操作，研究中盡量減少動物的使用量和動物所受的不適。所有大鼠在實驗前至少在動物中心飼養1周。大鼠按照隨機數字表法隨機分為5組(n=18)：(1)生理鹽水組(NS組)：鞘內注射生理鹽水20 μL，10 min后左后足底注射生理鹽水100 μL；(2)福爾馬林組(F組)：鞘內注射生理鹽水20 μL，10 min后左后足底注射5%福爾馬林100 μL；(3)右美托咪定對照組(DEX組)：鞘內注射DEX 2 μg/20 μL，10 min后左后足底注射生理鹽水100 μL；(4)右美托咪定+福爾馬林組(DEX+F組)：首先大鼠給予鞘內注射DEX 2 μg/20 μL，10 min后左后足底注射5%福爾馬林100 μL；(5)福爾馬林+右美托咪定組(F+DEX組)：首先在大鼠左后足底注射5%福爾馬林100 μL，10 min后鞘內注射DEX 2 μg/20 μL。觀察每組大鼠在福爾馬林注射后1 h內疼痛行為學變化，包括(縮腿、舔足、咬足等行為)。在足底注射福爾馬林40 min時間點，每組隨機取大鼠12只，采用免疫組織化學(n=6)和免疫印跡法(n=6)檢測大鼠脊髓背角SP表達情況；每組剩余6只大鼠繼續疼痛行為學觀察至實驗結束。

1.2 主要實驗儀器及試劑

冰凍切片機(Leica CM1950，德國)、計時器(traceable，美國)、DEX(200 μg/ 2 mL，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)、兔抗大鼠SP一抗(美國abcam公司)、兔超敏二步法免疫組織化學檢測試劑盒(PV-9001)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9032)購于北京中杉金橋生物技術有限公司、抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自康成生物公司。

1.3 方法

1.3.1 炎癥性疼痛大鼠模型的制備 大鼠適應環境1 h后，徒手固定大鼠后用100 μL微量進樣器在大鼠左足底皮下注射5%福爾馬林100 μL。

1.3.2 鞘內注射 按文獻[4]的方法進行鞘內注射給藥。使用25 μL微量進樣器在大鼠L5-6椎間隙進針，進樣器針尖與脊柱上方約成60～70°夾角，通過椎間隙接觸到骨質后減少10°左右夾角繼續緩慢推進，以大鼠出現輕微的甩尾反射視為穿刺成功。30 s內緩慢注射生理鹽水或DEX 2 μg/20 μL，穿刺后出現運動障礙的大鼠不納入統計數據。

1.3.3 疼痛行為學反應 大鼠足底注射福爾馬林后立即用計時器記錄大鼠1 h內每5 min內的縮腿和舔爪時間總和，本實驗采用Abbott等[5]所推薦的以縮腿及舔爪時間之和作為疼痛行為學反應的指標。觀察時，在飼養籠底以45°夾角放置一面鏡子，以便觀察動物后肢的活動情況。

1.3.4 二步法免疫組織化學染色 取福爾馬林注射后40 min時間點的各組大鼠，每組6只，過量的4%水合氯醛腹腔注射(20 mL/kg)深度麻醉，左心室插管入主動脈升部，150 mL冷生理鹽水快速灌流沖洗血液，然后給予200 mL預冷的4%多聚甲醛(多聚甲醛溶于0.2 MPB)緩慢灌流，維持3 h左右。取出脊髓組織，放入4%多聚甲醛PB溶液中4～6 h后轉移到30%蔗糖溶液中48～60 h直到脊髓組織沉底。沉底的脊髓組織取出后，取L4-6脊髓節段冷凍包埋劑(OCT)包埋后-20 ℃冰凍切片機中速凍40 min，沿脊髓組織冠狀位連續切片，厚30 μm，每5～6張脊髓組織切片取1張進行免疫組織化學分析，每只大鼠取10張。脊髓組織切片經PBS漂洗后在3%過氧化氫液和胎牛血清中封閉、漂洗后加入兔抗大鼠SP(1∶300稀釋)一抗，在室溫下反應1 h后，4 ℃冰箱中過夜；SP切片加入生物素化的山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體；DAB顯色，常規明膠貼片于載玻片上，梯度酒精脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片，24 h后光鏡下觀察并采集圖像。Image-Pro Plus圖像分析軟件測定脊髓背角淺層(Ⅰ、Ⅱ板層，Rexed分層法)SP免疫反應陽性纖維平均光密度(average optical density，AOD)，所有切片均在同一光強度下測定。

1.3.5 免疫印跡技術檢測 SP 在脊髓的表達 取建模后40 min時間點各組大鼠，每組隨機取6只。大鼠4%水合氯醛(20 mL/kg 腹腔注射)過量麻醉后，取脊髓組織稱重，研脆后加入裂解液，進行超聲波粉碎；低溫離心取上清液；BCA法蛋白定量；待測樣品 (蛋白含量20 μg) 加樣，電泳，電轉至PVDF膜。加入一抗：兔抗大鼠SP抗體(1∶400)和抗大鼠GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜后加入二抗。化學增強發光試劑與PVDF膜共孵育后顯影，定影。圖像進行目標條帶掃描(方正掃描儀F5600)，BIO-RAD的生物圖像處理系統 (PDQUEST)進行分析，以GAPDH為內參對照，對所測目標蛋白的條帶光密度值(optical density，OD)進行標準化，得到各組SP蛋白相對光密度值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 足底注射福爾馬林對大鼠疼痛行為學影響

NS組大鼠在觀察時間內未見明顯縮腿、舔爪反應；F組大鼠足底注射福爾馬林后，其注射足出現明顯的兩時相疼痛行為反應，第一時相為注射后立即開始，持續約5min；第二時相為福爾馬林注射后15～60min。F組大鼠疼痛評分最高值在福爾馬林注射后40min，其后疼痛評分值有少許下降但與NS組比較，差異仍有統計學意義(P<0.001)(圖1)。

2.2 鞘內注射DEX對福爾馬林致痛大鼠疼痛行為學影響

DEX組無明顯縮腿、舔爪反應，在各觀察時間點，DEX組和NS組大鼠疼痛評分差異無統計學意義；F+DEX和DEX+F組大鼠鞘內注射DEX后其疼痛評分降低，與NS組比較，差異有統計學意義(P均<0.001)；F+DEX和DEX+F組比較，鞘內注射DEX預處理可降低福爾馬林致痛大鼠的疼痛評分，與F+DEX組比較，差異有統計學意義(P<0.001)(圖1)。

aP<0.001，與NS組大鼠比較；bP<0.001，與F組大鼠比較；

cP<0.001,與F+DEX組大鼠比較。

2.3 免疫組織化學法檢測各組大鼠脊髓背角SP表達

取足底注射福爾馬林后40min時間點的各組大鼠(n=6)，免疫組織化學法檢測SP陽性產物AOD值。SP陽性反應產物呈棕褐色顆粒狀，主要表達在脊髓背角灰質淺層。DEX組SP陽性產物AOD值與NS組比較，差異無統計學意義；F組大鼠SP陽性產物AOD值顯著升高，與NS組比較，差異有統計學意義(P<0.001)；福爾馬林致痛大鼠鞘內注射DEX后，其SP陽性產物AOD值顯著降低，與F組比較，差異有統計學意義(P<0.001)；F+DEX和DEX+F組比較，鞘內注射DEX預處理可降低福爾馬林致痛大鼠的SP陽性產物AOD值，與F+DEX組比較，差異有統計學意義(P<0.001)(圖2，圖3)。

2.4 免疫印跡法檢測大鼠脊髓背角SP蛋白表達

取福爾馬林建模后40min時間點的各組大鼠(n=6)，免疫印跡法檢測脊髓背角中SP蛋白的表達情況。結果提示，各組大鼠脊髓背角中均觀察到有SP免疫陽性條帶。以GAPDH作為內參蛋白，采用相對光密度值定量檢測結果。NS組與DEX組SP蛋白免疫陽性條帶相對光密度值差異無統計學意義；F組大鼠脊髓背角SP蛋白免疫陽性條帶相對光密度值升高，與NS組比較，差異有統計學意義(P<0.001)；鞘內注射DEX減少炎癥性疼痛大鼠脊髓背角SP蛋白免疫陽性表達，DEX+F組、F+DEX組與F組比較，脊髓背角SP蛋白免疫陽性表達水平降低，差異有統計學意義(P均<0.001)；DEX+F組與F+DEX組比較，DEX+F組大鼠脊髓背角SP蛋白免疫陽性表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.001)(圖4，圖5)。

3 討論

大鼠福爾馬林疼痛模型是接近臨床病理性疼痛表現的持續性疼痛動物模型，模型成功復制率高，廣泛應用于炎癥性疼痛機制的研究。在嚙齒類動物，福爾馬林引起的炎癥性疼痛可表現出典型的雙相變化：第一時相為自發縮足反應期，在福爾馬林注射后立即出現，持續約5min；隨后是相對安靜的間歇期，持續約10min；第二時相為持續反應期，出現在福爾馬林注射后約15～60min。從疼痛發生的機制上看，第一時相為早發傷害性疼痛反應，為福爾馬林直接刺激外周感覺神經末梢引起；第二時相為遲發傷害性疼痛反應，指福爾馬林產生的外周局部炎性疼痛可使中樞脊髓神經元興奮閾值降低，興奮性增高即中樞敏化所致。但也有不同的觀點，通過外周單纖維記錄技術研究發現，福爾馬林誘發的雙相痛是由外周初級傳入Aδ和C纖維雙相放電所介導，即福爾馬林引起的第二時相疼痛(持續痛)反應也是外周傷害部位源性而非中樞敏化[6]。本研究發現SD大鼠足底注射福爾馬林后，大鼠有縮腿、舔爪及顫抖等疼痛行為學反應，同時，該反應呈現明顯的兩時相疼痛特點，說明本研究中炎癥性疼痛大鼠模型建模成功。

DEX是一種強效、高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮痛、鎮靜、抗焦慮、交感神經阻滯等作用[7]。本研究發現鞘內注射DEX(2μg/20μL)對福爾馬林所致的炎癥性疼痛大鼠具有明顯的鎮痛作用；另一方面，鞘內注射DEX(2μg/20μL)對正常大鼠(足底皮下僅注射生理鹽水的DEX組大鼠)的疼痛評分值無影響，說明鞘內注射DEX(2μg/20μL)僅對病理性疼痛大鼠產生鎮痛作用而對正常大鼠的痛閾無影響。

SP作為第一個被發現的神經肽，是經典的疼痛相關神經遞質。在脊髓，SP通過與其它神經遞質相互作用參與對疼痛信息的調制。有研究表明[8]：鞘內應用SP可產生熱痛敏，產生致痛效應。但SP在脊髓水平的作用仍有爭議，Wu等[9]研究表明SP在脊髓背角具有抑制神經元動作電位產生的前饋作用，參與脊髓水平的傷害性疼痛信息處理。本實驗發現，炎癥性疼痛大鼠脊髓背角SP陽性表達較正常大鼠顯著升高；鞘內注射DEX后，炎癥性疼痛大鼠脊髓背角SP陽性表達下調，疼痛緩解，說明DEX通過抑制大鼠脊髓背角SP水平升高對炎癥性疼痛的形成和維持產生抑制作用。

早在1983年Woolf[10]發表了一篇超前鎮痛的動物實驗研究。通過多年的臨床和基礎研究提示：超前鎮痛的實質就是通過一些干預措施(鎮痛藥物和/或鎮痛方法)避免或減少中樞敏感化和外周敏感化的形成，從而減輕或避免疼痛的形成和維持[11]。但至今對超前鎮痛的機制缺乏深入的了解，因此對其鎮痛效果及時限性仍存有爭議。中樞與超前鎮痛機制有關的部位包括脊髓和脊髓上結構。目前臨床常用的超前鎮痛藥物包括阿片類藥物、局部麻醉藥、非甾體類消炎藥、NMDA受體拮抗劑和α2受體激動劑等[12]。在脊髓水平，(1)DEX作用于脊髓背角一級神經元突觸前膜及二級神經元突觸后膜上的α2受體，通過激活胞內第二信使，使K+通道開放，細胞膜超極化，抑制細胞內Ca2+濃度增加，從而使SP釋放減少，神經激肽-1受體內化，二級神經元的動作電位難以產生，從而在突觸處抑制傷害性信息傳遞[13-14]；(2)由于α2-腎上腺素能受體為突觸前受體，激活后可抑制突觸前神經元去甲腎上腺素釋放，抑制疼痛信號向大腦傳遞；(3)DEX也可以通過增加脊髓中間神經元釋放乙酰膽堿、一氧化氮、降鈣素基因相關肽等神經遞質參與疼痛調節。在脊髓上水平，藍斑是延髓-脊髓下行性去甲腎上腺素能通路的起源，在傷害性神經遞質的調控中起重要的作用。DEX作用于藍斑α2-腎上腺素能受體，抑制該下行性傳導通路，最終減少脊髓P物質的釋放和其他傷害性肽類的釋放，產生鎮痛作用[15]。

本研究結果證實：鞘內注射DEX可抑制炎癥性疼痛大鼠脊髓背角SP的釋放，減少外周傷害性刺激向中樞的傳導，避免中樞敏化，最終產生鎮痛作用；炎癥性疼痛大鼠預先鞘內給予DEX，其脊髓背角SP表達比后給予DEX的炎癥性疼痛大鼠減少，提示DEX對炎癥性疼痛的鎮痛作用具有超前鎮痛效應。由于本研究結果是建立在動物實驗的基礎上，是否能安全、有效的將鞘內注射DEX運用于臨床還需進一步的研究證實。

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(學術編輯：林菁燕)

Preemptive analgesic effect，dexmedetomidine in inflammatory pain rats

WEN Song1，WANG Jie1，XIAO Zhi2，LI Ying1

(1.DepartmentofAnesthesiology，AffilatedHospitalofZunyiMedicalCollege；2.TheResearchCenterforMedicine&Biology，ZunyiMedicalCollege,Zunyi563099,Guizhou,China)

Objective：To observe the analgesic effect of the intrathecal injection of the dexmedetomidine (DEX) on acute inflammatory rats induced by subcutaneous injection of the formalin,and the expression alterations of the substance P (SP) in the spinal dorsal horn on rats.The study was also designed to test the preemptive analgesic effect of DEX on the inflammatory pain rats.Methods： The formaline-induced inflammatory pain model of SD rats was established by subcutaneous injection of formalin into the plantar surface of the left hind paw of rats.The DEX was intrathecally injected and the pain-related behaviors were studied.The expression changes of substance P (SP) in the spinal dorsal horn(L4-6)were detected by using the immunohistochemistry and Western blot methods.Results: The cumulative pain scores were increased and the SP-positive expression in the dorsal horn was up-regulated after intraplantar injection of formalin.The intrathecal injection of DEX decreased the cumulative pain scores and inhibited the SP-positive expression.Additionally,the analgeic effect of the pre-injection DEX was stronger than the post-injection.Conclusion: Intrathecal injection of the DEX can attenuate the inflammatory pain in rats through inhibiting the expression of SP expression in the dorsal horn of spinal cord,and the administration of DEX has a preemptive analgesic effect at the spinal level in formalin-induced inflammatory pain.

Dexmedetomidine；Inflammatory pain；Preemptive analgesia；Substance P

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.002

貴州省科學技術基金項目[黔科合J字LKZ(2011)21號] 收稿日期：2016-07-12

文松(1986-)，男，碩士，住院醫師。

李瑛，E-mail：zyliying1219-0321@163.com

時間：2017-3-6 21∶07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2107.004.html

1005-3697(2017)01-0005-05

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