雙阻滯位點特異性PCR鑒別鐵皮石斛及其近緣物種

董曉曼+蔣超+袁媛+查良平+彭代銀+趙玉洋

[摘要]建立一種快速、準確鑒別鐵皮石斛加工制品的方法。該研究通過對GenBank數據庫收錄的鐵皮石斛及其同屬近緣物種的ITS序列進行對比分析，根據變異位點設計雙阻滯位點特異性鑒別引物，并優化PCR條件，對鐵皮石斛及其69種近緣種共362個樣品進行擴增和檢測。結果顯示，在退火溫度為60 ℃的同一PCR反應中，鐵皮石斛均擴增出397 bp條帶，而其他69種近緣物種均無條帶，且該方法靈敏度高，檢出限可達0.03 mg·L^-1。該文所建立的位點特異性PCR方法可實現鐵皮石斛的準確鑒別，具有操作簡便、穩定可靠、應用范圍廣的優點。

[關鍵詞] 鐵皮石斛； 位點特異性PCR； 分子鑒定

[Abstract] Based on rDNA ITS sequences of Dendrobium officinale and the other 69 species of Dendrobium， a pair of dismatched allele-specific diagnostic primers， TPSH-AS1F and TPSH-AS1R were designed to authenticate D. officinale from the other species. Thebidirectional PCR amplification were performed using the diagnostic primers with the total DNAs of the original plants or processing products as a template. When the annealing temperature was raised to 60 ℃， only the template DNA of D. officinale could be amplified whereas the diagnostic PCRs of the other Dendrobium species were all negative. Compared with the other authentification methods， the bidirectional PCR amplifications is not only simpler and time-saving but practical and effective.

[Key words] Dendrobium officinale； PCR amplificationof specificalleles； molecularidentification

近20年來，分子鑒別技術尤其是特異性PCR鑒別已廣泛用于食品和中藥的真偽鑒別。作為特異性PCR的發展性技術，位點特異性PCR（allele-specific PCR）、擴增阻滯突變系統及其衍生方法利用引物末端不完全匹配形成的擴增阻滯差異，已能夠對單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點差異進行分型從而實現近緣物種的鑒別^[1-3]。但位點特異性PCR鑒別在設計引物時需要選擇適宜的GC含量且盡量不含有重復序列，PCR擴增時也需要嚴謹的反應條件，因退火溫度、酶量、引物量、循環數、模板濃度、Taq酶種類均可影響SNP分型結果，導致該方法應用推廣受限^[4]。

對一些難以進行基因分型的近緣物種，需要建立更加穩定的鑒別方法。鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是石斛屬石斛組藥用植物，同組有30余個近緣物種，其形態和化學成分相似，傳統手段鑒別困難。核糖體ITS序列在部分石斛種間存在極其顯著的差異，且在種內具有一定的遺傳穩定性，多個石斛屬物種均有各自特異性SNP位點，是石斛物種鑒別的有效DNA分子標記^[5-9]。但核糖體DNA多為高重復串聯序列，且具有很高的GC含量，設計的位點特異性PCR引物需要非常嚴格的PCR反應條件^[10-12]。為解決這一問題，本文在完成亞洲大陸石斛屬分子系統學研究的基礎上，以鐵皮石斛為研究材料，利用石斛屬ITS區變異豐富的特點，通過2個SNP位點設計1對均在3′端倒數第2位引入錯配堿基的雙阻滯特異性引物，使得僅鐵皮石斛出現陽性條帶，而石斛屬其余69種物種均無條帶，為鐵皮石斛與近緣物種的鑒別提供了分子依據。

1 材料

1.1 植物材料 選取來自不同產地的鐵皮石斛168個單株和69種194個石斛屬近緣物種的莖362個DNA樣品進行位點特異性PCR研究。植物樣品采自我國安徽、云南、廣西、浙江、重慶、貴州、西藏、海南、臺北等省市，以及尼泊爾、老撾、越南和泰國，分別由安徽中醫藥大學俞年軍教授和中國科學院植物研究所金效華博士鑒定，憑證標本保存于中國中醫科學院中藥資源中心，見表1。

1.2 儀器 Veriti^TM 96孔梯度PCR儀（Applied Biosystems公司）；GeneAmp 9700型PCR儀（Applied Biosystem公司）；TC-512梯度PCR儀（TECHNE公司）；5810R型高速冷凍離心機（Eppendorf公司）； DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）； SYNGENE凝膠成像系統（GENE公司） 。

1.3 試劑 rTaq DNA聚合酶、SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、DL 2 000 DNA Marker購自TaKaRa公司； 2× High-Fidelity Master Mix購自北京擎科新業生物技術有限公司。

2 方法

2.1 SNP位點的篩選和引物設計 利用BioEdit軟件對GenBank數據庫中石斛屬植物的ITS序列進行同源對齊，校對后分析鐵皮石斛與近緣石斛物種差異SNP位點，利用Primer Premier 5.0軟件設計鐵皮石斛雙阻滯位點特異性鑒別引物TPSH-AS1F/TPSH-AS1R，序列及PCR擴增程序見表2。

2.2 基因組總DNA的提取和PCR擴增條件的確定 取100 mg干燥樣品，研磨成細粉后，置于1.5 mL離心管中，加入65 ℃預熱的CTAB沉淀液750 μL，充分震蕩混勻，65 ℃溫育40 min，低速離心5 min，棄去上清，剩下管內材料按改良CTAB法^[13]提取總DNA。取不同樣品DNA，調整至濃度約30 mg·L^-1，用通用引物ITS1和ITS4進行PCR反應以檢測模板DNA質量。PCR反應體系為2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1 dNTPs，上下游引物各0.2 μL，0.5 U rTaq酶（5 U·μL^-1），1 μL DNA模板。反應在Veriti^TM 96孔梯度PCR儀上進行，反應程序見表2。反應結束后在PCR反應體系內加入5 μL 6×loading buffer，混勻后于EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統觀察成像。

利用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R進行位點特異性PCR反應，并分別考察退火溫度、PCR循環數、Taq酶種類、不同PCR儀對鐵皮石斛鑒別結果的影響，以確定最優反應體系和條件。

2.3 鐵皮石斛位點特異性PCR鑒別 取來自安徽、云南、廣西、浙江等地362個石斛樣品，提取DNA并進行雙阻滯位點特異性PCR擴增以檢測方法的準確性和適用性。PCR反應體系為2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R（10 μmol· L^-1）各0.25 μL，0.2 U rTaq酶，1 μLDNA模板和19.8 μL ddH₂O。反應在Veriti^TM 96孔梯度PCR儀上進行，反應程序見表2。

2.4 檢出限調整 鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的總DNA至300 mg·L^-1，并進行逐級稀釋依次獲得質量濃度為300，30，3，0.3，0.03 mg·L^-1的系列DNA。以所稀釋的DNA為模板進行鐵皮石斛雙阻滯位點特異性PCR，以能擴出條帶的最低濃度確定檢出限。

2.5 隨機雙盲測試 按醫學雙盲測試的要求，即樣品編號、實驗操作與結果判定3個環節分由3人完成，隨機取40批經過確證的樣品，提取DNA并進行雙阻滯位點特異性PCR擴增。

3 結果與分析

3.1 鐵皮石斛雙阻滯位點特異性PCR引物設計 對石斛屬33個物種175條ITS序列分析表明，ITS序列60位和417位為鐵皮石斛特有SNP位點，鐵皮石斛60位為C，其他石斛為非C；鐵皮石斛417位為A，其他石斛均非A。利用這2個SNP位點設計鐵皮石斛雙阻滯位點特異性PCR引物，使正向引物TPSH-AS1F 3′端與鐵皮石斛60位完全匹配，并在3′端倒數第2位引入錯配C，反向引物TPSH-AS1R 3′端與鐵皮石斛417位完全匹配，并在3′端倒數第2位引入錯配A以增強引物特異性。利用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R進行位點特異性PCR時，鐵皮石斛模板末端與正反向引物匹配，擴增出長397 bp的條帶，而石斛屬其他近緣物種因擴增阻滯使擴增速度大大降低，見圖1。

3.2 條件優化 位點特異性PCR衍生出的方法會受到退火溫度、循環數、Taq DNA聚合酶及不同升降溫等條件的影響。由于鐵皮石斛、霍山石斛和細莖石斛親緣關系較近^[14]，且是市場上流通的主要品種，商品形態上較為相近，更易混淆、難于鑒別，故本文挑選鐵皮石斛、霍山石斛及細莖石斛，對這4個因素進行了考察，發現退火溫度和Taq DNA聚合酶對雙阻滯位點特異性PCR具有較大影響，而PCR儀及PCR循環數影響小。結果表明退火溫度在58～62 ℃時，僅鐵皮石斛獲得約400 bp的特異性條帶，退火溫度過低時鐵皮石斛近緣物種也產生微弱條帶，導致假陽性，見圖2A；當循環數為27～36時，僅鐵皮石斛出現特異性鑒別條帶，而循環數超過36次時，鐵皮石斛近緣物種也可觀測到微弱擴增條帶，見圖2B；在所選擇的6種DNA聚合酶中，僅rTaq聚合酶能實現鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的鑒別，見圖2C；對不同PCR儀進行考察，表明3種PCR儀均可用于鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的鑒別，見圖2D。

3.3 準確性測試 所建立的方法對鐵皮石斛的專屬性鑒別能力，使用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R對鐵皮石斛及其同屬69個近緣物種進行了雙阻滯位點特異性PCR，僅鐵皮石斛出現397 bp的鑒別條帶，近緣物種均無條帶（部分鑒定結果見圖3A），說明雙阻滯位點特異性PCR能專一性鑒別鐵皮石斛。對鐵皮石斛主產區安徽、云南、浙江、廣西的362個樣品和來自亳州的22批鐵皮石斛楓斗進行鑒別也均可得到相同結果，見圖3B，說明該方法具有良好的適用性。

3.4 檢出限測試 優化后的PCR反應條件，對不同濃度的模板DNA進行特異性PCR。DNA模板質量濃度在30～0.03 mg·L^-1時，只有鐵皮石斛能擴增出397 bp的特異性鑒別條帶，且條帶亮度隨DNA模板濃度降低而減弱，模板DNA檢出限達0.03 mg·L^-1，見圖4。

3.5 隨機雙盲測試 為檢測方法的可靠性，隨機取40批經過確證的樣品，按醫學雙盲測試的要求運用本方法進行檢測，鑒別結果與正偽品信息一致，見圖5。

4 討論

石斛屬Dendrobium Sw.植物全世界約有1 000種，我國有74種2變種，而本研究選取了來自不同產地的鐵皮石斛168個和69種194個石斛屬的近緣物種共362個樣品進行位點特異性PCR研究，幾乎囊括了亞洲大陸石斛屬全部物種，且鐵皮石斛樣品量大，采樣地點多，具有一定代表性，對保障方法準確性具有重要意義。

位點特異性PCR具有操作簡便、實驗周期短的優點，理論上可對任意SNP位點進行分型，已被廣泛應用于藥材的真偽鑒定和鑒別研究^{[1-3，10-12，15-16]}。位點特異性PCR對反應條件較為嚴格，退火溫度、循環次數、Taq酶種類及PCR儀均可能影響鑒定結果，即當更換其中某一條件時，需重新調校其他條件，故在實驗操作方面，引物的篩選和實驗條件的優化尤為重要。目前已報道的利用位點特異性PCR對石斛屬植物鑒定方法多對復性溫度、DNA模板濃度及純度要求較高^[10-12]，容易導致方法重現性較低，應用受限。本文研究結果表明，退火溫度、PCR循環數和PCR儀對本方法鑒別結果均影響不大；PrimeSTAR HS DNA聚合酶與SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶及2×High-Fidelity Master Mix均為高保真酶，具有3′-5′外切酶活性，對DNA合成時的錯配堿基存在“識別—逸漏—反復識別”的過程^[17]，反應中DNA模板濃度、添加酶量及退火溫度均影響酶的聚合能力；采用的Taq酶無3′-5′外切酶活性，可造成混淆品因延伸反應擴增受阻而致反應速度大大降低；在方法建立中使用了雙盲測試，更進一步驗證了所建立方法特異性好、重復性高、穩定可靠。

本研究根據鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的ITS序列設計了3對特異性引物，發現引入錯配堿基的個數和位置對特異性引物擴增效果和鑒別特異性影響均較大。Kwok等^[18]研究表明，在引物3′端倒數第2，3個堿基的位置引入錯配對提高引物特異性的效果最好，且G/T錯配擴增相對容易。本實驗中在上下游引物3′端前一位均人為引入錯配，且所有錯配均為嘌呤-嘧啶替換模式，這種替換模式可有效阻滯69種鐵皮石斛近緣物種的非特異性擴增，而鐵皮石斛特異性擴增效果依然較好。此外，本方法的檢出限為模板DNA質量濃度在0.03～30 mg·L^-1，這可能與所使用的SNP位點位于具有高拷貝數的ITS序列上，故對降解程度較嚴重的石斛加工制品仍能有效鑒別，所以本方法對市場上鐵皮石斛加工制品的真偽鑒別有重要參考價值，也對鐵皮石斛加工制品的質量穩定性和安全性提供技術保障。

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[責任編輯 呂冬梅]