基于microRNA和mtDNA的相關性闡述活血化痰中藥防御心肌缺血再灌注損傷的分子機制

林飛+陳恒文+石卓林+趙國安+孫業喜

[摘要]大量基礎和臨床研究顯示活血化痰中藥通過調節脂質代謝防治心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），然其機制尚不十分清晰。經研究線粒體DNA，microRNAs以及脂質代謝參與MIRI整個過程且影響預后，線粒體DNA mtDNA突變是引起心肌缺血和再灌注心肌細胞損傷的首要因素，microRNAs通過表達下降或過表達調控相關基因加重或減輕MIRI損傷，而作為膽固醇轉運關鍵調節器的miR-33通過位于線粒體上CROT，PGC-1α，AMPK等相關基因而調控脂質代謝，然同mtDNA和microRNAs的相關性研究卻較之為少。因此深入研究miR-33同mtDNA，MIRI的相關性，探析活血化痰中藥是否靶標miR-33調節脂質代謝，引起mtDNA突變或缺失對于防治MIRI有著重要意義。

[關鍵詞] 冠心病； 線粒體； microRNA； 脂質代謝

[Abstract] A large number of basic and clinical studies have shown that the Chinese herbs with promoting blood circulation and resolving phlegm effects could prevent and treat myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI） by regulating lipid metabolism. But its mechanism is not yet clear. The studies show that mitochondrial DNA （mtDNA）， microRNAs and lipid metabolism participate in the whole process of MIRI and affect the prognosis. mtDNA mutation is the primary factor to cause myocardial ischemia and reperfusion myocardial cell damage. microRNAs aggravate or reduce MIRI injury by down-regulating or up-regulating related genes expression， while miR-33， as a key regulator of cholesterol transport， regulates lipid metabolism through CROT， PGC-1α， AMPK and other genes located in the mitochondria. There are less studies on correlation between miR-33 and mtDNA， microRNAs. Therefore， further studies on the correlation between miR-33 and mtDNA， microRNAs， as well as the discussions on whether the traditional Chinese medicine （TCM） with promoting blood circulation and resolving phlegm effects could target miR-33 to regulate lipid metabolism and inducemt DNA mutations or deletions， would have important significance for the prevention and treatment of MIRI.

[Key words] coronary heart disease； mitochondria； microRNA； lipid metabolism

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfution injury，MIRI）是引起靜脈溶栓、經皮冠狀動脈介入術、冠狀動脈旁路移植術后心律失常、心肌舒縮功能降低、能量代謝障礙、細胞凋亡的首要病理因素之一^[1]。近些年，中藥以其獨特多途徑多靶點的協同療效廣泛應用于MIRI的防治，大量研究表明中藥通過減少氧化應激、改善能量代謝、防止細胞凋亡、抑制鈣超載、調節炎性介質、抑制線粒體膜通透孔、增加線粒體DNA拷貝數^[2-8]等多個途徑防御心肌缺血再灌注損傷，然迄今為止，其保護機制尚未完全清晰。經研究線粒體DNA，microDNA以及脂質代謝的異常是決定MIRI的重要因素之一，中藥是否通過上述作用防御MIRI，則是本研究主要內容。

1 線粒體DNA突變對MIRI造成雙重損傷

心肌缺血-再灌注損傷包括缺血和含氧血流恢復后的再灌注損傷，二者疊加對心肌細胞造成雙重的損傷，在這雙重損傷之中mtDNA突變扮演了重要的角色。mtDNA存在線粒體內是機體唯一的核外遺傳物質，同電子呼吸鏈毗鄰，為裸露的環狀單螺旋結構，缺乏蛋白質保護，容易受到線粒體本身氧化磷酸化過程中的氧自由基以及疾病、遺傳和環境等因素影響而發生突變，突變率比核DNA高，具有母系遺傳、半自主復制、異質性、隨機分配、高突變率、高利用率、閾值效應和協同效應等特性^[9-10]。

1.1 缺血損傷 心肌缺血與mtDNA突變互為因果是造成冠心病發生發展的主要因素。心肌缺血引起mtDNA損傷，當冠脈狹窄、心肌細胞缺血和反復出現低血氧時導致線粒體ATP合成和氧化磷酸化抑制，細胞難以維持正常的ATP含量，造成能量生成障礙、細胞內外離子穩態失衡、乳酸酸中毒、心肌舒縮功能障礙嚴重影響心臟功能，此外缺血的心肌細胞產生大量的氧自由基能則增加mtDNA損傷和氧化磷酸化不足，大范圍mtDNA突變或缺失涉及多個mtDNA的基因編碼區域，造成氧化磷酸化基因轉錄水平異常，可導致氧化磷酸化障礙，ATP產生不足，引起組織器官損傷。心肌缺血的程度與心肌細胞mtDNA缺失突變率相關，mtDNA突變是加重心肌缺血，導致線粒體功能障礙，促進炎癥反應，細胞凋亡和細胞衰老^[11]的重要因子，影響氧化磷酸化，使線粒體功能紊亂，加速細胞凋亡。現代研究顯示mtDNA損傷存在于動脈粥樣硬化病變的各個時期，即在動脈粥樣發展早期即有mtDNA損害的發生并促進易損斑塊的發生發展，如在動脈粥樣硬化早期即發現mtDNA 4 977 bp顯著突變，而在冠心病患者中發現mtDNA 4 977，7 436，10 422 bp^[9]，tRNAThr15927G>A^[12]均不同程度升高。

1.2 再灌注損傷 缺血對心肌細胞mtDNA造成的損傷是一個漫長的量變到質變的積累過程，受到疾病、遺傳、地理以及環境等多因素的影響，而再灌注引起的大量氧自由基、鈣超載、炎癥反應使原本突變的mtDNA更是雪上加霜不堪一擊。研究報道突變的mtDNA在MIRI時，導致線粒體內酶失活、呼吸鏈傳遞或氧化磷酸化功能缺陷，從而出現ATP合成障礙，產生過多氧自由基加重mtDNA損傷減少或mtDNA拷貝數，引起mtDNA數量轉錄水平下降、mtDNA片段缺失和線粒體結構損傷和線粒體功能下降^[9，13-19]，如MIRI釋放的大量ROS可迅速引起呼吸鏈酶活性下降和mtDNA 4 834 bp片段缺失，導致該線粒體電子呼吸鏈不可逆的氧化磷酸化障礙^[20]，造成缺血組織在恢復血液灌注后，缺血和再灌注二者疊加引起線粒體的損傷，啟動心肌細胞凋亡或壞死^[21]，使得心肌損傷反而加重，造成可逆性缺血損傷加重，亦可能促進可逆性缺血損傷轉化為不可逆損傷。

2 microRNAs參與調控MIRI

高等真核生物基因組編碼microRNAs（miRNAs），miRNA廣泛參與心臟發育和心血管疾病的發生發展^[22]，參與并調控MIRI整個過程^[23]，miRNAs是一種大小約21～23個堿基的單鏈小分子RNA，由核基因組編碼，miRNAs作為基因組的調控開關通過和靶基因miRNAs堿基配對構成基因沉默復合體降解miRNAs或阻礙其靶基因的翻譯。

2.1 miRNAs與MIRI miRNAs調控線粒體形態、參與線粒體自嗜、影響線粒體代謝、參與線粒體介導的細胞凋亡而調控線粒體的功能、結構和代謝，在心肌MIRI中miRNAs通過影響能量代謝、細胞凋亡、ROS生成、鈣超載、離子通道等因素調控線粒體^[24-25]。研究顯示諸多^[23]miRNAs參與MIRI，如保護性miRNAs有miR-2，miR-125b，miR-133a，miR-146a，miR-494，在MIRI之后具有過表達的miR-2促進心臟纖維化、加重心功能障礙；miR-125b減弱促凋亡因子p53，Bak-1和Bax表達；miR-146a引起NF-κB的活性和炎癥因子產物；miR-494調節凋亡蛋白。損傷性miRNA有miR-1，miR-15a/15b，miR-29a/29c，miR-320，作用機制分別為miR-1抑制蛋白激酶和熱休克蛋白加重心肌缺血再灌注損傷；miR-15a/15b，miR-29a/29c，miR-320作用不同的靶基因促進細胞凋亡^[23]。此外，miRNAs也通過影響Bcl-10，ATG9，Cx43蛋白，beclin-1進而影響自噬小體的形成，對自噬起到抑制或激活，從而影響心肌I/R損傷的結局^[26]。同時在MIRI中miR-92a和miR-126的表達與氧自由基和心肌細胞凋亡有關聯，可能為早期診斷和預測無復流現象提前干預提供思路，并且他汀類藥物的干預可以改變miR-92a和miR-126的表達^[27]。

2.2 microRNA與動脈粥樣硬化 現代研究提示miRNAs可能預測急性心血管事件的發生，實現疾病的診斷、鑒別診斷、危險分層及預后的判斷成為動脈粥樣硬化疾病生物標志物^[28-30]，其原因主要是血液循環中miRNAs具有穩定性、細胞間具有交流功能、序列進化保守，調控靶基因，組織和疾病特異性，且檢測高度敏感性和特異性。miRNAs參與動脈粥樣硬化的發生發展整個過程的多個途徑調節多個基因，基礎研究顯示涉及miR-1，miR-74，miR-126，miR-145，miR-155，miR-146a/b，miR-135b-5b，miR-499a-3p^[31-37]等多個miRNAs，其中miR-1可能通過介導靶基因TGF-β2調控巨噬細胞凋亡參與動脈粥樣硬化，miR-74可能在DNA轉錄、心臟發育、投射神經元發育、B細胞活化、血管生成等生物過程發揮重要作用^[32]。臨床研究顯示冠心病患者外周循環血中miR-19b，miR-21，miR-133a，miR-208a，miR-499a等miRNAs參與冠心病的形成發生發展，其中miR-19b抑制內皮增殖miR-21通過調控炎性遞質sCD40L而穩定斑塊，miR-133a，miR-208a和miR-499a則與冠狀動脈狹窄程度成正比^[38-40]。再者，學者研究MicroRNAs對冠心病的證候有著一定的影響，如冠心病血瘀證的miR-146b-5p，miR-199a-5p，CALR和TP53，痰濁證miR-363-5p，miR-668，RIPK2和STK4，不穩定心絞痛中miR-146b-5p，miR-199a-3p，IL2RB和FASLG均有不同程度上調下調^[41]。

3 miRNAs與mtDNA^[42-46]

作為生命過程重要參與者的miRNAs由核基因和線粒體基因編碼與mtDNA一起對生命體有著重要的影響，二者相互作用具有緊密的聯系，核基因編碼的miRNAs通過調控核基因編碼或線粒體編碼的相關蛋白的表達影響線粒體結構和功能，線粒體基因編碼miRNA直接調控線粒體基因表達或轉運至胞質調控核基因的表達影響疾病的發生發展。

3.1 miRNAs直接或間接影響mtDNA miRNAs涉及線粒體代謝、線粒體氧化磷酸化、電子傳遞鏈組件、脂質代謝等多個代謝過程^[47]，通過多種途徑調節線粒體代謝、形態和生物合成從而影響線粒體功能，進一步影響mtDNA，如癌癥、代謝綜合征、肌病、心血管等疾病中均提示miRNAs參與調節^[48]。2011年，Barrey等對miRBase 中742 miRNAs進行研究，結果顯示在人類肌小管的線粒體 RNA片段中有243 miRNAs顯著表達，在人線粒體基因組中發現25種pre-miRNA和33種miRNA的潛在編碼序列，并首次證實人類肌細胞線粒體中存在miRNA前體（pre-mir-302a，prelet-7b）和成熟miRNA（mir-365）^[49]。

學者研究在心血管疾病伴糖尿病患者中加重MIRI的原因可能是同miRNA-200c與miRNA-141的過表達引起線粒體超氧化物歧化酶降低導致ROS升高所致^[50]。低氧下表達變化最顯著的miR-210通過靶標三羧酸循環和抑制呼吸鏈活力抑制線粒體代謝，或直接作用于COX10影響線粒體呼吸鏈^[48]。在MIRI中，缺氧通過激活p53抑制miR-499的轉錄，促進發動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）去磷酸化，導致Drp1在線粒體中積累并激活Drp1介導的線粒體裂解，最終促進心肌細胞凋亡^[51]，而心肌細胞凋亡時與氧化應激密切相關，最終影響線粒體結構、功能以及mtDNA。據報道影響ROS的miRNAs主要有充當抗氧化作用的miR-145，miR-23b，miR-210，充當促氧化作用的miR-335，miR-34a，miR-338，miR-210，miR-181^[48]，而氧化應激則是冠心病患者mtDNA損傷的首要原因，其機制主要是細胞色素c氧化酶是線粒體呼吸鏈的關鍵酶，細胞色素c氧化酶亞基Ⅱ是其活性中心，其活性的改變導致線粒體呼吸鏈的電子傳遞受阻，并直接將電子泄露于線粒體基質內，使超氧陰離子產生增多，使線粒體內的氧化應激水平增高，導致mtDNA損傷^{[ 9]}。

3.2 線粒體基因編碼miRNAs調控mtDNA 線粒體基因可能編碼miRNA，直接或間接調控mtDNA或核基因的表達。mtDNA僅有37個基因，編碼13種線粒體氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）復合體亞基，22種tRNA和2種rRNA^[9]，線粒體有自身的轉錄和翻譯體系，線粒體DNA的復制、轉錄以及線粒體mRNA翻譯都是在線粒體內膜內進行的。線粒體基因編碼miRNA稱為mitomiRs，“mitomiRs”可以作為“載體”，核基因組和線粒體基因組均存在mitomiR靶基因位點，并在細胞水平感知和響應動態變化的線粒體微環境^[48]，如線粒體lncRNA ASncmtRNA-2i 可能通過hsa-miR-4485和hsa-miR-1973影響內皮細胞衰老和老化^[52]，mitomiRs作用方式可能有以下幾個方面^{[42，48，53-54]}：①Mitomirs 可能具有線粒體調控分子的效力；②Mitomirs可能靶標線粒體表面的核編碼基因；③線粒體可以被看作是涉及到Ago2和miRNA的細胞信號傳導的平臺；④mtDNA的轉錄、復制可能受mitomiRS的調控。如mitomiRs （mir-146a，-133b，-106a，-19b，-20a，-34a，-181a，-221） 也在miRs中主要涉及到細胞衰老以及炎癥衰老，甚至具有轉錄后調節或線粒體基因組精細調節的作用^[53-54]。上述機制可能同多核苷酸磷酸化酶（polynucleotide phosphorylase，PNPase）介導細胞核編碼的miRNAs輸入線粒體相關，PNPase存在于線粒體膜間隙，PNPase可能通過調控線粒體mitomiRS參與線粒體DNA氧化損傷的調節，線粒體PNPase的表達減少會引起mitomiRS表達譜的改變，MitomiRS表達變化可能導致線粒體結構及功能的改變。

4 miR-33參與調節脂質代謝

線粒體功能的正常發揮離不開核基因組和線粒體基因組的相互作用，miRNAs可能參與細胞核和線粒體間的信息交流，參與能量代謝，脂質代謝、細胞凋亡和線粒體動力學多個過程，介導基因轉錄后調控，調節生理病理條件下線粒體結構和功能^[43，47-48]。

4.1 miR-33 miRNAs被認為是膽固醇逆向轉運、HDL生物合成、細胞內膽固醇流出、膽汁分泌的關鍵調節器，且與動脈粥樣硬化發生發展密切相關，并可診斷疾病，判斷預后^[55]，其中沉默miR-33能夠影響脂質代謝，促使膽固醇逆向轉運，降低線粒體氧化損傷，修復mtDNA突變，保護線粒體的結構和功能，防御缺血性冠心病的發生發展。其中miR-33修復mtDNA的機制主要是能夠直接抑制人類8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（OGG1）的表達或者通過AMPK間接抑制大鼠或者人類OGG1的表達，在人類冠狀動脈和頸動脈斑塊中OGG1呈顯著減少，OGG1的減少引起mtDNA的損害勝于對核DNA的損害，進而增加巨噬細胞NLRP3炎性體的活化，增加IL-1β，導致動脈斑塊中更多的凋亡加速動脈斑塊的形成，此外，mtDNA的關鍵調節因子核因子2和核轉錄Y亞基α也調節OGG1的表達，同時OGG1的過表達則改善線粒體功能，可能在動脈粥樣硬化中起著保護作用^[56]。其中Karunakaran D和Price N L的報道^[57-58]指出miR-33通過靶基因（CROT，HADHB，CPT1，PGC-1α，AMPK，NRF1/2 PDK4，SLC25A25）導致線粒體呼吸鏈和ATP的生成和維持正常線粒體生物合成，同時提出沈默miR-33在線粒體功能紊亂疾病（冠心病）的發生發展中可能扮演著重要的角色。因此，miR-33作為防御缺血性心臟病的靶基因，其重要作用可能是通過調節位于線粒體上相關基因而執行。

4.2 miR-33相關靶基因及通路 在miR-33的調節基因中，與線粒體有著密切的聯系，涉及到下述相關基因及通路，見表1。

首先，CPT1a位于線粒體外膜，CROT耦合短鏈脂肪酸將其轉運到線粒體內，CPT1a將長鏈脂肪酸轉運到線粒體內，HADHB是在線粒體內進行β氧化的關鍵酶，miR-33可以下調CPT1a，CROT，HADHB，抑制SREBP1抑制脂肪酸氧化使極低密度脂蛋白急劇上升。其次miR-33促進PDK4，PGC-1α，PPARs上調增加線粒體生物合成，前期研究證實活血化痰方促進PGC-1α，PPARs的表達，再者miR-33沉默腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK]影響能量代謝，也有學者認為miR-33能夠調節吞噬細胞炎癥反應和抗動脈粥樣硬化^[61]。此外，高脂飲食能夠使肥胖miR-33處于上調狀態，通過沉默miR-33能夠調節整個身體的氧化代謝但不影響代謝紊亂^[62]，還能靶向參與脂肪酸β氧化相關基因CPT1A，CROT和HADHB，從而減少脂肪酸的降解。此外，除miR-33外，miR-122，miR-370，miR-378/378，miR-302a，miR-106b等也被報道參與調控膽固醇穩態和脂肪酸代謝^[63]。

5 展望

mtDNA和miRNAs均參與心肌缺血再灌注的整個過程，線粒體作為脂質代謝的場所，在調節脂質代謝防御MIRI尤為重要。學者研究miR-144-3p的上調增加維持線粒體功能的關鍵基因PGC-1α，mtTFA的表達，同樣也增加細胞ATP、細胞活力以及mtDNA的拷貝數^[64]，前期研究結果顯示活血化痰中藥通過影響脂質代謝，影響脂肪酸β氧化PGC-1α-PPARα通路，進而影響能量代謝；通過抗氧化應激，促進線粒體生物合成通路PGC-1α-NRF1-mtTFA，增加mtDNA合成，2條通路以PGC-1α為交點共同防御心肌I/R損傷，促進心功能的恢復^[8]，此外番茄紅素可通過保護線粒體DNA減輕大鼠MIRI，其保護線粒體DNA的作用可能與其減輕線粒體氧化應激以及穩定線粒體中的Tfam有關^[65]。在針灸防治MIRI的研究中，“標本配穴”法電針通過激活抗氧化酶，抑制氧自由基，減輕心肌mtDNA氧化損傷，同時通過上調內源性SIRT1途徑，激活其下游PGC-1α/NRF-1/mt TFA信號通路，保護心肌mt DNA而抗心肌缺血損傷^[66]。

然而，盡管miR-33作為調節脂質代謝的靶基因對線粒體有著重要的影響，但是機制尚不清晰，面對我國日益增多的冠心病人群，且僅是在我國2015年僅冠心病介入治療術共計567 583例^[67]，挽救了數千萬患者的生命，但是治療后的溶栓失敗、心力衰竭、冠脈再狹窄、無復流、心律失常、支架內血栓等問題一直以來影響臨床救治。并且學者研究活血藥植物多酚、阿魏酸均能夠干預異常脂質代謝，其中阿魏酸可能通過增加巨噬細胞源性泡沫細胞表面ABCA1和ABCG1的表達水平，促進膽固醇流出，從而發揮抗動脈粥樣硬化的作用^[68-69]，并且上文已述ABCA1和ABCG1則同miR-33密切相關。因此深入研究活血化痰中藥是否通過靶標基因miR-33調節脂質代謝，調控線粒體的功能、結構，維護線粒體DNA正常復制轉錄，保護心肌組織對于闡明活血化痰中藥防治冠心病的機制有著重要的意義。

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[責任編輯 張寧寧]