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太子參新品種“施太1號”區域試驗穩定性評價

2017-04-06 21:33:24肖承鴻周濤江維克楊昌貴周潔康傳
中國中藥雜志 2017年5期

肖承鴻+周濤+江維克+楊昌貴+周潔+康傳志+黃艷+宋健

[摘要]該文分析太子參新品種“施太1號”的田間穩定性與適應性,為太子參新品種的審定和推廣應用提供參考。選擇4個不同種植區域,以“黔太子參1號”(品種)和“SB-C”(品系)為對照,測量農藝性狀、藥材性狀、藥材品質等指標,比較3個品種(系)在不同種植區域間的表型差異。結果表明相比2個對照品種(系),18個農藝性狀中“施太1號”有10個性狀區域間變異系數最小,其他8個性狀處于中間;8個藥材性狀和品質指標中浸出物含量、太子參環肽B含量、50 g塊根數、單個塊根重、單株藥材重5個指標區域間變異系數在3個品種(系)中最小;基于3個品種(系)在4個種植區域間的表型差異,可劃分為3類,新品種“施太1號”單獨聚為一類,而“黔太子參1號”和“SB-C”存在明顯交集。與“黔太子參1號”和“SB-C”相比,新品種“施太1號”在農藝性狀、藥材性狀、藥材品質等評價指標方面穩定性、一致性和適應性較好,可作為新品種進行保護、審定和推廣應用。

[關鍵詞] 太子參; 施太1號; 品種選育; 區域試驗; 穩定性

[Abstract] To provide guidance for certification, popularization and application of Pseudostellariae Radix new variety, the regional adaptation and stabilities of "Shitai No.1" were evaluated. The "Qian taizishen No.1" and "SB-C" varieties (strains) were used as the control varieties. The agronomic, medicinal material traits and medicine quality were used as evaluation index to compare the phenotypic difference of the three varieties (strains) in four planting areas. Compared to the control varieties, 10 agronomic traits of "Shitai No.1" had the smallest coefficient of variation among the 18 agronomic traits, and other 8 agronomic traits placed the middle level. Among 8 medicinal material traits and medicine quality indicators, the coefficient of variation of different regions of the extract content, pseudostellarin B content, the number of 50 g root tuber, the plant medicinal materials weight and weight of single root of "Shitai No.1" were the smallest compare to other varieties (strains). It could be divided into three groups based on the phenotypic difference of the three varieties (strains) in four planting areas. The "Shitai No.1" was classified as one group, while the "Qian taizishen No.1" and "SB-C" had cross clustering. The regional stability of several index about agronomic traits, medicinal material traits and medicine quality of "Shitai No.1" were better than that of the control varieties (strains). "Shitai No.1" was suitable for planting, popularization and application in the appropriate ecological areas of Guizhou province.

[Key words] Pseudostellariae Radix; Shitai No.1; breeding; regional test; stability analysis

中藥材新品種選育的重要目標是藥材質量好、產量高、適應性廣。品種的適應性是指品種在不同環境條件下表現出較為均一的穩定變化,在各種環境中都表現出高低相對一致的生產性能[1]。區域試驗是評價品種穩產性、適應性的重要手段,任何品種都具有區域的適應性,在品質好、產量高的前提下,穩定性好的品種適應性廣,可推廣的范圍就大,而穩定性不理想的品種則只能在其適應的區域和生產條件下推廣應用。因此,區域試驗品種穩定性評價尤為重要。

太子參為大宗常用中藥材,系石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根,具有益氣健脾、生津潤肺之功效[2]。太子參現已在貴州黔東南地區建立了大規模的種植基地,也是貴州省中藥材重點發展品種之一。然而,由于種質及產區環境的差異,造成太子參產量、藥材性狀及質量參差不齊,難以實現商品藥材的標準化。目前,太子參藥材品質形成研究主要集中在種質評價、栽培條件優選、適宜區劃等方面[3-9]。為了保障太子參品質的優良性,有必要開展太子參新品種的選育研究。

本研究是在課題組種質評價的基礎上,以藥材品質、產量等為目標,系統選育出“施太1號”,該品種具有產量好、藥材商品等級高、抗性強等優良特征。為觀察驗證“施太1號”在貴州地區綜合適用性,選擇貴州省內4個不同生態類型區域進行新品種區域試驗穩定性評價,旨在全面了解“施太1號”適應性,為“施太1號”的品種審定和推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 種質

“施太1號”為課題組選育的品種,對照品種(系)“黔太子參1號”(品種)和“SB-C”(品系)為貴州三泓藥業股份有限公司提供。編號為:施太1號(S)、黔太子參1號(Q)和SB-C(C)。

1.2 試驗區域

設4個試驗區,分別位于貴州施秉縣牛大場鎮、城關鎮,黃平縣新州鎮和余慶縣龍溪鎮,編號為:施秉縣牛大場鎮(ND)、施秉縣城關鎮(XQ)、黃平縣新州鎮(HP)和余慶縣龍溪鎮(YQ)。其中牛大場鎮長坳試驗區中心海拔941 m,E107°56′42.76″,N27°08′17.17″;新州鎮太翁村試驗區中心海拔915 m,E107°50′26.18″,N26°57′26.36″;龍溪鎮田壩村試驗區中心海拔743 m,E107°44′08.19″,N27°17′21.77″;城關鎮新橋村試驗區中心海拔864 m,E108°01′39.61″,N26°57′32.53″。試驗區域均屬于高原季風性氣候,年平均氣溫14~16 ℃,年總積溫5 500 ℃,無霜期225~294 d,年降水量1 060~1 200 mm。試驗區為新開墾,黃壤,微酸性,肥力中等,排灌方便。

1.3 試驗設計

采用隨機區組設計,4個試驗區,每個試驗區共設9個小區,每個品種(系)3個重復。小區面積為0.8 m×5 m=4 m2,小區間設置0.4 m空地作為隔離。2014年12月栽種,栽種前將充分發酵腐熟有機肥做基肥撒土面,覆土稍許平栽。株距5~7 cm,覆土7~10 cm,其他田間管理同大田一致。

1.4 農藝性狀測量

2015年5月15日,太子參花果期,測量農藝性狀,指標包括:株高、冠幅長、冠幅寬、葉片數、葉寬、葉長、主莖粗、主莖節數、莖節長、最長分枝長、閉鎖花果數、葉干重、地上生物量12個性狀;2015年7月20日,測量塊根性狀,指標包括:單株塊根數、單株塊根鮮重、中上部直徑、塊根長和單株塊根干重6個性狀。同一試驗區每個品種(系)隨機取樣10個單株,共測120份單株。

1.5 藥材性狀測量

2015年7月20日,太子參藥材采收期采集塊根。同一試驗區每個品種(系)隨機取樣10個單株,共得120份單株。此外,每個品種(系)采集250 g左右的混合樣本,共得12份混合樣本,洗凈,烘干(40 ℃)。測量每株藥材的質量,并從單株樣本中隨機選取15個塊根測量中上部直徑、單個塊根重;從混合樣本中隨機稱取50 g,測量50 g藥材的塊根數。

1.6 浸出物含量測定

依據《中國藥典》2015年版第四部水溶性浸出物測定法(通則2201)項下測定[10]。精密稱取太子參粉末約4 g,置250 mL的錐形瓶中,精密加水100 mL,密塞,冷浸,前6 h時時振搖,再靜置18 h后,濾過,精密取續濾液20 mL,置干燥至恒重的蒸發皿中,水浴蒸干,再于烘箱中(105±5) ℃干燥3 h,置干燥器中冷至室溫,精密稱重。共測單株樣本120份。

1.7 太子參多糖含量測定

依據參考文獻[11]中比色法測定多糖含量。

1.7.1 儀器與試劑 紫外-可見分光光度計(CBC Cintra20型,澳大利亞照生公司),電子天平(EL104型,梅特勒-托利多儀器有限公司);葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號110833-201205),乙醇、濃硫酸、苯酚均分析純。

1.7.2 對照品溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品15.10 mg,置25 mL量瓶,加水溶解并稀釋至刻度,即得0.604 g·L-1標準儲備液,從中精密吸取1 mL儲備液,加水定容至25 mL,配制質量濃度為0.024 2 g·L-1的對照品溶液。

1.7.3 供試品溶液的制備 精密稱取粗粉約0.1 g,置100 mL圓底燒瓶中,加80%乙醇70 mL水浴回流30 min,趁熱過濾,濾渣用80%熱乙醇洗滌2次,每次10 mL,將濾渣及濾紙置原燒瓶中,加水80 mL,90 ℃熱浸1 h,趁熱過濾,濾渣以熱水洗滌3次,每次5 mL,合并濾液與洗液,放冷后加水定容至100 mL,搖勻,精密吸取10 mL定容至50 mL,搖勻,即得供試品溶液。

1.7.4 標準曲線繪制 精密吸取儲備液0.5,0.8,1.0,1.3,1.5,1.8 mL,分別置于25 mL量瓶中,加水定容至刻度。分別精密吸取上述各溶液2 mL置于25 mL試管中,依次加入4%苯酚1 mL,濃硫酸5 mL充分混勻,冷卻至室溫。484 nm波長下測定。以吸光度為縱坐標,對照品濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程Y=0.056 6X-0.004 6(r=0.999 6)。表明葡萄糖溶液質量濃度在3.020~10.872 mg·L-1具有良好的線性關系。

1.7.5 含量測定 精密吸取供試液、對照品溶液各2 mL置25 mL試管中,按1.7.4項下自“依次加入4%苯酚1 mL”起操作。多糖含量=[A×C×D×f/W]×100%,式中A為供試液平均吸光度與對照品吸光度之比,C為稀釋后葡萄糖標準溶液質量濃度(g·L-1),D為多糖稀釋因數,f為多糖換算因子(2.38),W為樣品稱樣量(mg)。共測單株樣本120份。

1.8 太子參環肽B含量測定

依據參考文獻[12]中HPLC測定太子參環肽B含量。

1.8.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀( LC-20AD型,日本島津);太子參環肽B對照品(中國科學院昆明植物研究所,純度以95%計),乙腈為色譜純,甲醇為分析純,水為娃哈哈純凈水。

1.8.2 色譜條件 C18柱(Wondasil,4.6 mm×250 mm,5 μm);以水為流動相A,乙腈為流動相B,梯度洗脫(0~10 min,2%~10% B;10~40 min,10%~45% B;40~45 min,45%~55% B);檢測波長203 nm;柱溫30 ℃;流速0.9 mL·min-1。

1.8.3 對照品溶液的配制 精密稱定太子參環肽B對照品適量,置量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL含太子參環肽B 0.453 2 mg的儲備液。再取一定量儲備液用甲醇稀釋成每1 mL含太子參環肽B 18.13 μg的對照品溶液。

1.8.4 供試品溶液的制備 精密稱定粉末約2 g,精密加入50 mL甲醇,稱重,超聲45 min,放冷,稱重,用甲醇補足失重,搖勻,濾過,精密移取25 mL續濾液至蒸發皿中,水浴加熱濃縮至干,殘渣加甲醇溶解,轉移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,過0.45 μm濾膜,取續濾液作為供試品溶液。

1.8.5 含量測定 分別精密吸取對照品、供試品溶液10 μL進樣測量,按外標一點法計算含量。共測單株樣本120份。

1.9 太子參氨基酸含量測定

依據參考文獻[6]中柱前衍生化-HPLC測定氨基酸含量。

1.9.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(LC-20AD型,日本島津);氨基酸測定分析包(天津博納艾杰爾科技有限公司,包括三乙胺,異硫氰酸苯酯,正亮氨酸,17種氨基酸標準溶液,除胱氨酸濃度為1.25 mmol·L-1外,其余氨基酸濃度為2.5 mmol·L-1),乙腈為色譜純,鹽酸為分析純。

1.9.2 色譜條件 Pntulips C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以醋酸鈉水溶液為流動相A,以80%乙腈水溶液為流動相B,梯度洗脫(0~5 min,0%~5% B;5~13 min,5% B;13~14.5 min,5%~7% B;14.5~20 min,7%~12% B;20~25 min,12%~23% B;25~35 min,23%~33% B;35~38 min,33%~75% B;38~40 min,75% B;40~45 min,75%~100% B;45~46 min,100%~0% B;46~60 min,0% B);檢測波長 254 nm;柱溫 30 ℃;流速 1.0 mL·min-1。

1.9.3 供試品溶液的制備 取粉末0.5 g,精密稱定,置于25 mL的安瓿瓶中,精密加入含0.1%苯酚的6 mol·L-1鹽酸10 mL,振搖使其充分溶解分散,置(110±5)℃烘箱中水解24 h,取出冷卻,過濾,精密量取濾液5 mL于蒸發皿中蒸干,殘渣加水5 mL溶解,用0.45 μm濾膜過濾,供衍生使用。

1.9.4 衍生化反應 精密量取氨基酸標準溶液及供試品溶液200 μL,分別置于1.5 mL離心管中,向每個離心管中加入正亮氨酸內標溶液20 μL、三乙胺乙腈溶液100 μL、異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL,搖勻,室溫放置3 h,然后加入正己烷400 μL,振搖后放置10 min,取下層溶液,0.45 μm濾膜過濾,取濾液200 μL,加水定容至1 mL,搖勻即得。

1.9.5 含量測定 精密吸取對照品、供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,測定。氨基酸含量=f1×C×V×10-4/f2×W,式中f1=樣品中各氨基酸峰面積/正亮氨酸峰面積,f2=標準溶液中各氨基酸峰面積/正亮氨酸峰面積,C=氨基酸標準品質量濃度(mg·L-1),V=樣品溶液定容體積,W=稱樣量(g)。共測單株樣本120份。

1.10 數據分析

采用SPSS 17.0計算平均數(X)、標準差(s)及聚類分析;根據結果將所有材料劃分為10個等級,按第1級[Xi<(X-2s)]到第10級[Xi>(X+2s)],每0.5s為1級,每1級的相對頻率(Pi)用于計算多樣性指數,即Shannon-Weiner index(H′)的計算公式如下:H′=-∑Pi×lnPi,式中Pi為某一性狀第i級別材料份數占總份數的百分比,Xi為第i級中的數據[13]。

2 結果分析

2.1 不同區域間葉部性狀的遺傳差異分析

從6個葉部性狀分析結果可知,不同性狀間變異系數差異較大,在13.34%~52.73%,3個品種(系)葉片數和葉干重區域間變異系數均大于40%;相對于對照品種(系),S品種的葉部性狀區域間變異較小,其中冠幅寬(19.91%)、葉片數(40.28%)、葉寬(18.89%)、葉長(15.59%)區域間變異系數在3個品種(系)中最小,冠幅長和葉干重處于第2位;3個品種(系)葉部性狀遺傳多樣性較為豐富,但品種(系)間差異不大,在1.786 4~2.071 1。表明相對于Q品種和C品系,不同試驗區域間S品種葉部性狀差異性較小,相對穩定,見表1。

2.2 不同區域間莖部及果實性狀的遺傳差異分析

莖部及果實性狀分析結果可知,性狀間變異系數差異較大,最大的為閉鎖花果數,Q品種的區域間變異系數達93.66%,最小的為株高,S品種的區域間變異系數僅為13.03%;相對于對照品種(系),S品種的莖部及果實性狀區域間變異較小,6個性狀中,株高(13.03%)、主莖節數(20.15%)、閉鎖花果數(64.13%)、莖節長(24.23%)4個性狀的區域間變異系數在3個品種(系)中最小,主莖粗和最長分枝長處于第2位;除主莖節數外,3個品種(系)莖部及果實性狀遺傳多樣性較為豐富,S品種遺傳多樣性指數略低于對照品種(系),主莖粗(1.898 6)、主莖節數(1.398 7)、最長分枝長(1.825 6)遺傳多樣性指數在3個品種(系)中最小。表明相對于Q品種和C品系,不同試驗區域間S品種莖部及果實性狀差異性較小,相對穩定,見表2。

2.3 不同區域間產量性狀的遺傳差異分析

3個品種(系)的塊根鮮重、地上生物量、地下生物量區域間變異系數較大,均大于36%,而塊根粗和塊根長區域間變異系數較?。?0.17%~20.82%);相對于對照品種(系),6個性狀中,S品種的塊根粗(10.17%)、塊根長(18.74%)的區域間變異系數在3個品種(系)中最小,其他4個性狀均處于第2位;3個品種(系)產量性狀遺傳多樣性較為豐富,但品種(系)間差異不大,在1.800 2~2.078 5。表明相對于Q品種和C品系,不同試驗區域間S品種產量性狀差異性較小,相對穩定,見表3。

農藝性狀差異性分析結果表明,相對對照品種(系),S品種的18個農藝性狀,有10個性狀的區域間變異系數在3個品種(系)中最小,其他8個性狀處于第2位,農藝性狀的遺傳多樣性較為豐富。綜合葉部、莖部、果實及產量性狀的平均值、最大值、最小值、標準差、極差、變異系數和遺傳多樣性指數,種植在不同試驗區的S品種農藝性狀較對照品種(系)穩定。

2.4 不同區域藥材性狀的區域試驗比較

3個品種(系)塊根的中上部直徑、單個塊根重和單株藥材重結果基本一致,均為ND區域的中上部直徑、單個塊根重和單株藥材重顯著高于其他3個區域,而在XQ,HP,YQ區域間無顯著差異。相對于對照品種(系),S品種的4個藥材性狀有3個變異系數最小,分別為單個塊根重(25.06%)、單株藥材重(14.15%)和50 g塊根數(14.07%)。結果表明,ND區域太子參藥材產量高、藥材商品性狀好;相對于Q品種和C品系,不同試驗區域間S品種藥材性狀差異性較小,相對穩定,見表4。

2.5 不同區域藥材品質的區域試驗比較

多重比較結果顯示,4個試驗區域的S品種浸出物和多糖含量有3個區域無顯著差異,而Q品種和C品系僅有2個區域無顯著差異;不同試驗區域的S品種和Q品種太子參環肽B含量均無顯著差異,而C品系僅3個區域無顯著差異;不同試驗區域的總氨基酸含量差異較大,S品種和C品系僅2個試驗區域無顯著差異,Q品種在4個區域均有顯著差異。變異系數結果顯示,相對于對照品種(系),S品種的4個藥材品質有2個變異系數最小,分別為浸出物(7.78%)和太子參環肽B(5.84%),其他2個藥材品質的變異系數處于第2位。結果表明,相對于Q品種和C品系,不同試驗區域間S品種藥材品質差異性較小,相對穩定,見表5。

2.6 不同品種(系)聚類分析結果

依據18個農藝性狀、4個藥材性狀及4個藥材品質平均值的相似度,采用SPSS軟件進行系統聚類。結果顯示,當相似距離為10時,3個品種(系)種植在4個區域的12份樣本可分為3類:其中Q品種的4個樣本及C品系的2個樣本聚為一類,分別為HP-Q,YQ-Q,XQ-Q,ND-Q和ND-C,YQ-C;C品系的HP-C和XQ-C為一類;S品種的YQ-S,HP-S,ND-S和XQ-S單獨聚為一類。表明相對于對照品種(系),S品種的性狀與這2個品種(系)有明顯的差異,且S品種的性狀相對較穩定,種植在不同區域的性狀相似性較大,并未出現與其他2個品種(系)交叉聚類的現象,見圖1。

3 結論與討論

每個品種都有其適宜種植的區域,把品種與區域特點結合起來,在適宜的區域種植相應的品種,能較大程度地發揮優良品種的優勢。區域試驗是鑒定品種品質、產量和穩定性的關鍵內容,是品種審定的必經程序,是品種推廣應用不可缺少的重要環節。太子參選育的目的是從現有人工栽培群體中篩選商品規格等級、產量、有效成分含量或抗性優良的品系,進而培育成優良品種?!笆┨?號”選育研究表明,藥材產量、商品等級、多糖含量和太子參環肽B含量優于對照品種(系)(另文發表),其農藝性狀、藥材性狀、藥材品質的多個指標的區域試驗品種穩定性優于對照品種(系),可在貴州適宜生態區域示范性種植和推廣應用。

表型性狀受基因和環境雙重影響,對品種基因效應、環境效應及兩者的相互作用的研究有利于選育廣泛適應性或特殊適應性品種,品種區域試驗可用區域內平均變異系數和區域間變異系數來評價引起表型差異的因素。本試驗結果顯示,施太1號(S)、黔太子參1號(Q)和SB-C(C)3個品種(系)所有農藝性狀的區域內平均變異系數均未達到區域間變異系數的一半,表明環境差異是引起太子參區域試驗品種間產生差異的主要原因。相同品種(系)種植在4個區域的太子參總氨基酸含量也存在顯著性差異,說明環境是影響太子參總氨基酸含量的主導因素,這與文獻[14]結果一致。

本文所分析的18個農藝性狀中,“施太1號”的葉片數、葉長、主莖粗等12個性狀的遺傳多樣性指數略小于“SB-C”,且有10個農藝性狀的區域間變異系數在3個品種(系)中最小。這說明“施太1號”農藝性狀區域試驗品種穩定性較好;但育種使其遺傳多樣性略有降低。這與文獻[15]報道現代育種導致作物遺傳多樣性的降低,使得作物改良的遺傳基礎變得越來越狹窄理論一致。

“施太1號”藥材性狀和品質是否穩定是衡量其穩定性和適應性的重要環節,結果顯示,8個藥材性狀及品質指標中,“施太1號”的浸出物含量、太子參環肽B含量等5個指標的區域間變異系數在3個品種(系)中最小,表明“施太1號”藥材性狀和品質區域間穩定性較好。多重比較顯示,中上部直徑、單個塊根重、單株藥材重、浸出物含量和多糖含量結果差異基本相似,這與文獻[11]報道太子參多糖含量與藥材外觀性狀存在顯著相關性一致,也提示浸出物含量可能與藥材外觀性狀存在一定的相關性。

本試驗對“施太1號”進行了一年多點區域試驗研究,初步探討了“施太1號”在貴州太子參主產區的適應性,缺乏對不同年份隨機變化的氣候條件適應性的信息,下一步將對“施太1號”進行多年多點區域試驗研究,更加全面探討“施太1號”區域試驗品種穩定性和遺傳穩定性。

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[責任編輯 呂冬梅]

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