以標準湯劑為基準建立丹參的質量評價方法

董青+於化桃+代云桃+趙嶸+范自全+王丹丹+朱超+陳士林

[摘要]市售的丹參配方顆粒質量差異大，主要原因是丹參原料飲片質量的不均一性、缺乏統一規范的生產工藝和系統的質量評價方法。配方顆粒和“標準湯劑”具有質量一致性。該文將從“標準湯劑”角度，建立評價丹參水煎液質量的系統評價方法，探索影響丹參配方顆粒質量均一性差的主要因素。制備丹參標準湯劑，建立指紋圖譜并測定丹酚酸B含量，采用UPLC-QTOF-MS對主要色譜峰進行結構確認；計算出膏率、指標成分轉移率和pH等參數，評價工藝的穩定性。結果顯示丹參標準煎液的主要成分為酚酸類成分，丹參煎液的出膏率、丹酚酸B的轉移率和pH變化不大，且所得標準湯劑的指紋圖譜相似度高，表明制備工藝的穩定性良好；標準煎液中丹酚酸B含量范圍波動大，主要源于丹參藥材中丹酚酸B含量的差異性。

[關鍵詞] 丹參； 標準煎液/湯劑； 質量評價； 出膏率； 轉移率

[Abstract] The quality of Danshen extract granules on market is largely different from each other mainly due to the heterogeneous quality of raw materials of Salvia miltiorrhiza， various producing procedures and lack of good quality evaluation method. Formula granule and "standard decoction" have the same quality. In this paper， a systematic evaluation method for the quality of Danshen decoction was established from the perspective of "standard decoction"， in order to explore the main factors affecting the quality uniformity of Danshen extract granules. Danshen standard decoction was prepared； then the fingerprint method was developed to determine the content of salvianolic acid B； and the main peaks in the fingerprint were identified with UPLC-QTOF/MS to clarify the chemical compositions of Danshen decoction. Three indexes were calculated to evaluate the stability of whole process， including the extraction ratio； transfer rate of index components and pH value. The results showed that the main components of Danshen decoction were phenolic acids， while the extraction rate， the transfer rate of salvianolic acid B and pH value were in a relatively stable level， and the similarity in the fingerprint of standard decoction was high， indicating that the preparation procedure was stable. The level of salvianolic acid B in the standard decoction was in a large range， which was mainly due to the difference in the quality of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma.

[Key words] Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma； standard decoction； quality evaluation； extraction ratio； transfer rate

丹參年需求量較大，為大宗藥材品種之一，其配方顆粒的質量是眾多學者討論的焦點。丹參為唇形科鼠尾草植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖，是最常用的活血化瘀中藥之一。其主要化學成分為水溶性的酚酸類化合物和脂溶性的二萜醌類化合物^[1]。已有學者對市場上丹參配方顆粒的質量進行了分析總結^[2-4]，主要問題如下：①成分組成差異大，丹參水提液的主要成分是酚酸類，有的廠家丹參配方顆粒中含有丹參酮Ⅱ_A等脂溶性成分，暗示該配方顆粒的生產中可能采用了乙醇提取工藝，表明已有的丹參配方顆粒生產工藝不統一；②指標成分含量不均一，丹酚酸B含量差異很大。造成上述問題的主要原因是由于原料飲片的質量不一致和缺乏統一規范的生產工藝造成的。

中藥“標準湯劑”，又稱中藥“標準煎液”，是按照臨床湯劑煎煮方法、經標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎液^[5]。中藥配方顆粒除了成型工藝外，其余的過程與傳統的湯劑基本一致。所以，配方顆粒的藥效物質組成和湯劑的基本保持一致，即二者的質量具有一致性。因此，可以以標準湯劑為“基準”，評價配方顆粒主要生產工藝和質量控制方法的合理性。2016年，陳士林研究員提出以中藥飲片標準煎液為標準，標化不同用藥形式，提高臨床用藥的準確性和療效的一致性^[5]。中藥標準煎液質量標準的制定將為所有源于飲片水煎液的制劑的質量標準的制定提供參考。

本文的主要研究目標：①從丹參標準煎液角度，探索影響丹參配方顆粒質量均一性的主要因素；②厘清丹參水煎液的成分組成，制定合理評價丹參水煎液質量的系統評價方法。對丹參的標準煎液的質量控制主要從三方面進行：①藥材選擇包括了丹參的主產區（山東和四川中江）和主要的藥材市場，符合2015年版《中國藥典》各項規定的藥材為12個批次，對藥材鑒定精確到物種；②標準煎液的制備過程，有統一的標準化操作，完全按照《中藥飲片標準煎液研究策略》中推薦的制法^[5]；③標準湯劑的質量控制，采用化學指標成分含量測定和指紋圖譜相結合的模式，且對主要共有峰進行成分鑒定，從整體定性和指標成分定量的角度對所得湯劑進行質量分析。從而實現對標準湯劑、配方顆粒等失去中藥外表特征的中藥制劑的有效質量控制。本文展示了對丹參標準煎液從源頭藥材質量控制、中間過程參數標定和標準煎液的化學指紋標定的整個質量控制過程，從而為實現丹參配方顆粒的穩定均一性提供思路。

1 材料

1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），ACQUITY UPLC-Class型超高效液相系統和Xevo G2-XS型Q-TOF高分辨質譜儀（美國Waters公司）。丹參藥材共12批丹參藥材，見表1，購于山東、河南、河北、四川中江、安徽亳州市場等地，包括了丹參的主產區，道地產區和國內的主要的藥材市場；DNA測序與數據庫比對鑒定為唇形科鼠尾草植物丹參S. miltiorrhiza的干燥根及根莖。丹酚酸B，購于北京世紀奧科生物技術有限公司，純度為99.02%。水為娃哈哈純凈水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 丹參標準湯劑的制備方法

稱取丹參飲片100 g，至于圓底燒瓶中，加8倍水，充分潤濕，放置浸泡30 min，加熱煮沸后回流提取30 min，趁熱3層紗布過濾，濾渣再加入6倍水回流提取20 min，濾過，合并濾液，并濃縮至500 mL即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

取2.1.1項下所得的丹參標準湯劑置于2 mL離心管中，稀釋10倍，12 000 r·min^-1離心5 min，取上清液即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加80%甲醇制成丹酚酸B質量濃度為0.1 g·L^-1的溶液^[3]，搖勻，作為對照品溶液。

2.2 HPLC含量測定

2.2.1 HPLC色譜條件

采用SilGreen HPLC C₁₈柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃，體積流量為1 mL·min^-1；進樣量為10 μL；流動相為0.1%磷酸（A）-乙腈（B），等度洗脫，兩相比例為A-B 78∶22；檢測波長286 nm^[6]。

2.2.2 HPLC分析方法學考察

2.2.2.1 線性關系考察 將對照品儲備液，分別用80%甲醇稀釋2，4，8，16，32，64倍，按2.2.1項下的色譜條件測定，進樣10 μL，以進樣量10 μL 中對照品質量（μg）為橫坐標，286 nm波長下的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。丹酚酸B的線性方程為y=9 057.4x-96.596，r=0.999 1。

2.2.2.2 精密度試驗 取供試品溶液按HPLC色譜條件連續進樣6次，每次進樣量為10 μL，丹酚酸B峰面積RSD為1.4%，符合含量測定要求。

2.2.2.3 穩定性試驗 取供試品溶液放置0，1，4，6，12，24 h后按HPLC色譜條件進樣10 μL進行測定，記錄所有共有峰的峰面積，24 h內丹酚酸B峰面積RSD為2.2%，符合含量測定要求，說明丹參供試液在24 h內穩定。

2.2.2.4 重復性試驗 取同一批樣品，按供試品備樣方法平行制備6份供試品溶液，分別按HPLC色譜條件進樣10 μL進行測定。丹酚酸B峰面積RSD為2.5%，說明本實驗采用的方法重復性良好。

2.2.2.5 回收率試驗 平行精密量取已知丹酚酸B含量的供試品溶液6份，分別加入丹酚酸B對照品0.1 mg，混勻，按照供試品制備方法備樣，進樣10 μL，記錄丹酚酸B峰面積，結果顯示其平均回收率為101.6%，RSD為2.7%，表明該方法可以用于丹酚酸B含量的準確測定。

2.2.3 HPLC含量測定

分別精密吸取12批供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項下的色譜條件測定，記錄286 nm波長下丹酚酸B的色譜峰面積，帶入標準曲線進行計算，結果見表2。結果顯示12批丹參（DS1～DS12）的標準湯劑中，按照投入藥材量計算，丹酚酸B的提取率為2.0%～4.7%，平均提取率為（3.1±0.9）%；根據各批藥材不同的出膏率，浸膏粉中丹酚酸B的質量分數為4.9%～11.6%，平均值為（6.8±2.0）%。

2.3 UPLC指紋圖譜測定

2.3.1 UPLC色譜條件

采用 Acquity UPLC HSST3 C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters 公司）；柱溫為30 ℃，體積流量為0.3 mL·min^-1；進樣量為1 μL；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）^[7]，梯度洗脫（0～5.5 min，8%～19% B；5.5～11.5 min，19%～22% B；11.5～18.5 min，22%～30% B；18.5～22 min，30%～70% B；22～27 min，70%～90% B；27～29 min，90% B；29～32 min，90%～8% B）；檢測波長286 nm。

2.3.2 UPLC指紋圖譜采集與分析

分別精密吸取12批供試品溶液1 μL，注入超高效液相色譜儀，按2.3.1項下的色譜條件測定，得12批丹參提取物286 nm下的UPLC指紋圖譜，見圖1。圖譜采用藥典委推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012）”軟件進行色譜峰匹配，計算譜圖的相似度。所有藥材的相似度位于0.992～0.999，見表3。共有峰匹配結果顯示，丹參標準湯劑的共有峰有12個，其中峰面積百分比大于2%、峰形好的有共有峰有7個。以9號丹酚酸B作參照，計算7個共有峰的相對保留時間、相對峰面積、峰面積百分比、峰面積RSD，見表4。

2.4 質譜指認

2.4.1 質譜條件

采用Xevo G2-XS QTOF質譜儀，電噴霧電離離子源 （ESI），離子化模式為正、負離子，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣體為高純度氮氣，溫度為550 ℃，流速為800 L·h^-1，毛細管電壓為1.0 kV，錐孔電壓為30 V，掃描范圍m/z 50～1 200。亮氨酸-腦啡肽（m/z 554.261 5）作為外標（Lock Spray^TM）進行質量實時校正。

2.4.2 色譜峰的指認

吸取2.1.1供試品溶液1 μL，注入UPLC-QTOF/MS系統，按2.3.1項下的色譜條件運行，記錄質譜信號，各成分在負離子模式條件下有較高的響應。采用MassLynx 4.1 對正負離子模式總離子流圖進行處理，采用UNIFI 1.8 數據處理系統，通過比對精確相對分子質量、特征碎片峰，并結合MassFragment^TM確定化合物的相對分子質量、分子組成和可能分子式；比對已建立的目標數據庫和丹參已知化合物的文獻報道^[7-8]，對286 nm波長下主要共有峰進行了鑒定，相關離子推斷見表5，共鑒定出10個共有峰，UV及質譜總離子流圖見圖2。

2.5 丹參標準湯劑過程穩定性評價指標參數的測定

2.5.1 出膏率

分別取2.1.1項下的供試品溶液50 mL，干燥，稱取浸膏質量（m），根據如下公式計算標準湯劑的出膏率，出膏率=干膏量（E）/飲片量（m）×100%=m×10/100×100%。結果見表2，13批煎液出膏率為37%～55%，平均值為（44.2±5.3）%，不同批次的出膏率相差不大。

2.5.2 轉移率

分別將丹酚酸B帶入如下公式計算標準湯劑的轉移率，轉移率=湯劑中指標成分量/飲片中指標成分量×100%。結果見表2，轉移率以丹酚酸B計算為35.5%～57.5%，平均轉移率為（43.3±6.4）%，相對穩定。

2.5.3 pH

將pH精密試紙浸入丹參溶液中，0.5 s后取出與標準色版比較，即得pH。平行測定3次，取平均值，結果見表2，pH為5.0，不同批次之間沒有差異。

3 討論

藥材標準湯劑的組成成分有別于藥材飲片本身，質量評價方法不能盲目套用《中國藥典》規定的藥材飲片的質量標準。對所得丹參指紋圖譜共有峰鑒定結果顯示，丹參標準湯劑的主要成分包括丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸H/I、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和異丹酚酸B^[2，8]。指紋圖譜結果顯示，丹參標準湯劑指紋圖譜與丹參總酚酸提取物的指紋圖譜組成相似^[6]。因此，丹參標準湯劑的主要成分為丹酚酸類成分，而脂溶性成分如丹參酮Ⅱ_A基本檢測不到。所以，丹參標準湯劑質量標準中僅對丹酚酸B進行了含量測定，所用指標成分不同于藥典中藥材的水溶性和脂溶性成分的雙重指標。該結果提示丹參生產工藝評估和產品的質量控制方法的選擇，要考慮到配方顆粒產品所含化學成分與傳統飲片的差異，不要完全參考《中國藥典》或其他文獻中的藥材或飲片的方法。

丹參標準湯劑中的丹酚酸B的濃度變化大主要源于藥材本身，而生產工藝的規范化保證了工藝的穩定性。煎液中丹酚酸B的提取率為2.0%～4.7%，位于均值的67%～158%。大多推論認為該現象與丹酚酸B的熱不穩定性有關，在煎煮、濃縮過程中丹酚酸B會部分水解為原兒茶醛、丹參素和丹酚酸A^[2，9]，且轉化率隨著加熱時間的延長而提高。但是，制備標準湯劑的合格丹參藥材中丹酚酸B的質量分數變化范圍為5.1%～11.4%，位于均值的74%～165%，因此，丹參標準湯劑中的丹酚酸B的濃度變化幅度與丹參藥材本身基本一致。而且，標準湯劑的工藝參數（丹酚酸B）轉移率位于37.3%～57.5%，位于均值的82%～133%，轉移率基本穩定，表明丹酚酸B雖然熱不穩定，但是規范化的工藝操做仍能保證丹酚酸B的穩定轉化，從而保證其轉移率的穩定性，保證所得丹參煎液指紋圖譜的高度相似性。

本文所得12批丹參標準煎液的相似度值均大于0.99，相似度良好，表明所得丹參標準湯劑化學輪廓相似度高。丹參標準煎液的平均出膏率為（44.2±5.3）%，出膏率為37%～55%，位于均值的75%～125%；丹酚酸B的平均轉移率為（43.3±6.4）%，位于均值的82%～133%；pH均為4.0。這些數據表明，本文所用標準湯劑制備工藝穩定，只要保證藥材質量的穩定性，即可獲得質量均一穩定的丹參煎液。

采用本文建立的方法，所得丹參標準煎液中丹酚酸B提取率為2.0%～4.7%，平均值為（3.1±0.9）%，位于均值的67%～158%，浸膏粉中丹酚酸B平均質量分數為（6.8±2.0）%，均位于均值的72%～170%。這些數據表明丹參標準煎液的中丹酚酸B的含量范圍波動大。因此，①建議制定丹參標準湯劑的質量標準時，應放寬丹酚酸B的濃度范圍；②對于生產廠家，為了生產出質量均一穩定的丹參配方顆粒，生產工藝的規范化是基礎，保證藥材質量的均一性穩定是關鍵。

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[責任編輯 孔晶晶]