副豬嗜血桿菌病診斷方法研究進展

金曉君

（建湖縣近湖街道畜牧獸醫站，江蘇建湖 224730）

副豬嗜血桿菌病診斷方法研究進展

金曉君

（建湖縣近湖街道畜牧獸醫站，江蘇建湖 224730）

副豬嗜血桿菌病快速敏感的檢測技術不僅對于及時采取措施防控疫情蔓延等至關重要，還能及早發現新菌株，找出最危險的病原菌并開發相關疫苗，在防控疫情時掌握主動。用于診斷副豬嗜血桿菌病的方法有很多，其中有適合臨床大批量血清檢測的ELISA方法，ELISA具有操作步驟簡單、敏感性高和特異性好等很多優點。

副豬嗜血桿菌病；診斷方法；研究進展

對于副豬嗜血桿菌病的診斷在很大程度上仍依賴于病原的分離與培養，這對于發現病情和及時診斷帶來一定的困難。副豬嗜血桿菌的不同菌株可在一個豬場內流行和傳播，從同一只豬身上，甚至在同一臟器內，可以分離出多株副豬嗜血桿菌。因此，臨床診斷時無法鑒定出是哪一株副豬嗜血桿菌分離株是致病菌株。

1 病原學檢測

根據臨床癥狀、剖檢病變進行細菌分離鑒定是副豬嗜血桿菌病的經典診斷方法。然而該菌培養條件苛刻，生長過程需要額外的NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），且很難從患病動物中分離到HPS，尤其是經抗生素治療后，其分離更加復雜。

2 流行病學及臨床癥狀

副豬嗜血桿菌只感染豬，主要存在于豬的上呼吸道（鼻腔、扁桃體和氣管前段等）內，通過豬群間的接觸和空氣飛沫及污染物傳播。臨床上主要感染2～4月齡的豬，特別是5～8周齡的小豬，感染高峰見于保育期的4～6周齡。主要臨床癥狀表現為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行。主要剖檢病變表現為纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、多關節炎和腦膜炎，心包積水，腹膜積水等。母源抗體和天然免疫對抵抗HPS感染很重要，在敏感豬群內，HPS引起的死亡主要發生在幼豬，有些豬群在斷奶后1周就開始發病，這表明仔豬缺乏母源抗體保護力。當繁殖和呼吸綜合癥病毒（PRRSV）、圓環病毒2型（PCV-2）、偽狂犬病毒（PRV）、豬流感病毒（SIV）感染后，幾乎總是伴隨著副豬嗜血桿菌感染，這已成為仔豬保育期死亡主要原因。近年來，還有從細菌性肺炎、化膿性支氣管炎病變中分離到副豬嗜血桿菌，通常將此菌看作是繼發性病原菌。根據病程的經過，大致可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型和隱性型5種類型，但所有這些類型可隨條件的變動而互相轉變，不能截然區分。最急性型：可表現為無癥狀突然死亡。

3 病理變化

剖檢病死豬，可見胸腔出現纖維素性胸膜炎，腔內存在大量的淡紅色液體及纖維素性滲出物凝塊；腹腔內有多量透明黃褐色滲出液，有的呈膠胨狀凝塊。心包炎，心包積液，心包內有奶酪樣或豆腐渣樣滲出物，使外膜與心臟粘連在一起，形成“絨化心”；心肌有時有出血點。全身淋巴結腫大，呈暗紅色，切面呈大理石樣花紋；關節腫大，關節腔內有漿液性滲出性炎癥，有不等量的黃色或淡紅色液體，有的呈膠凍樣。肺臟呈纖維素性胸膜肺炎，肺呈暗紫紅色，臌脹，有纖維素性滲出物覆蓋在肺表面，有的肺與胸腔的側壁粘在一起；支氣管內有黃白色或淡紅色泡沫樣滲出物；肺間質灰白色到血樣，膠凍樣水腫是本病主要特征性病理變化之一。脾臟腫大，呈暗紅色。肝臟腫大，表面有灰白色小壞死灶。腎臟腫大有少量出血點，腎盂有淤泥狀物沉積。關節囊內有黏膿性紅色滲出物，關節囊壁充血、出血、水腫。

4 毒力因子及診斷方法研究進展

副豬嗜血桿菌的毒力因子十分復雜，各毒力因子的作用機理及毒力因子之間的相互聯系至今未被發現。近年來，人們作出許多嘗試去鑒定Hps的毒力因子或毒力標記，已經提出有關Hps許多毒力因子的推測，包含細菌的菌毛，外膜蛋白，莢膜，脂多糖，神經氨酸酶，轉運結合蛋白，hhdA和hhdB基因等。探索副豬嗜血桿菌致病性相關的毒力因子已經成為研究的熱點和重點。在副豬嗜血桿菌毒力因子中，外膜蛋白是目前研究最多且成果顯著的一個。Mcvicker等在副豬嗜血桿菌中發現了兩個與流感嗜血桿菌具有同源性的外膜蛋白P2和P5，該蛋白與細菌黏附有關，在毒力株和非毒力株中P2蛋白的大小有所不同，在毒力株中為48ku，在非毒力株中為55ku，可通過此項區分毒力株和非毒力株。目前，HPS實驗室診斷應用最廣泛的是PCR方法，其具有敏感性高、特異性好、穩定性強和快速的優點，可用于Hps感染的早期診斷和流行病學調查。劉建奎等針對HPS16SrRNA序列設計一段特異性引物，建立了快速準確鑒定HPS的PCR診斷方法。用于副豬嗜血桿菌血清學診斷方法ELISA檢測方法具有操作簡單、時間短、敏感性高，可用于大批量的抗原或抗體樣品檢測。王艷利用全菌作為包被抗原建立HPS抗體間接ELISA方法，具有較好的實驗效果，石碧等提取HPS細菌莢膜多糖（CPS）作為抗原建立ELISA，具有很好的特異性。陳善真等利用表達純化的外膜蛋白（P5）建立HPS抗體間接ELISA方法。賈愛卿、李鵬、李淼都利用表達純化的HPSompP2蛋白作為抗原建立HPS間接ELISA方法。

4.1 病原學方法

一般認為，病原菌的分離鑒定是檢測HPS的基本但較繁瑣的方法。臨床上從患病動物的培養物中很難分離到該病原菌，特別是經過抗生素治療的患病動物，使得HPS更難分離和培養；加上HPS的菌落偏小，及復雜的生化試驗鑒定等。所以，臨床上HPS的分離、培養和鑒定的方法并不作為常規的診斷檢測方法。目前，臨床上使用免疫組化技術（IHC）從試驗感染的臨床病料可以分離鑒定HPS，但是采用此方法檢測的多抗與淀粉樣前體蛋白（APP）存在交叉反應，所以IHC技術臨床意義上存在一定的局限性。

4.2 血清學方法

血清學方法因其特異性、快速和靈敏得到了廣泛的應用。國內外已經建立起來的血清學方法主要包括間接血凝試驗、瓊脂擴散試驗、補體結合試驗、乳膠凝集試驗等，其中補體結合試驗可以檢測HPS抗體滴度，存在一定的交叉反應；瓊脂擴散試驗是比較有效的方法之一，缺點是檢測時間偏長。

4.3 分子生物學方法

隨著生命科學的快速進展，在科研領域中，鑒于血清學方法存在波動性、不準確和不一致性，病原菌的檢測中引入了新的分子生物學方法。目前，應用于HPS檢測的分子生物學方法主要是針對DNA分子水平的檢測，包括實時熒光定量PCR、常規PCR、原位雜交等檢測方法，以及RFLP-PCR、REF、ERIC-PCR等新型的分子生物學方法可以鑒定不同血清型的病原菌。

5 診斷中的一些注意問題

由于HPS營養要求復雜，分離較為困難，需要在典型新鮮病料上采集、適宜的培養條件才能夠提高其臨床分離率，因此，在病料采集時，要選取臨床癥狀典型且最好未經抗生素治療的病豬，要盡快采取多個新鮮組織樣品。同時應注意，僅從鼻腔、扁桃體或氣管等組織臟器中分離細菌，是不能夠確診HPS，因為HPS是上呼吸道的共棲菌，應從內臟如心肺組織，心包液、胸膜積液，關節液、心血、腦脊液等處進行病原分離。

6 結語

副豬嗜血桿菌病在病毒性疫病感染后繼發感染或與其他疫病混合感染，使豬群的病情復雜化，病死率增加，給全世界養豬業造成了巨大經濟損失。本病沒有很好的治療措施，只能以預防為主，采取綜合措施加以防控。迄今為止，已對HPS進行了一系列的研究探索，取得了許多顯著的成就，同時也存在很多難題，相當一部分的臨床分離株并不難具體的血清型定型，HPS的感染分子機制并不清楚，以及一些常規的檢測HPS的方法也存在一定的局限和困難。這些難題都需要科研工作者深入研究，以便更加了解HPS和尋找到更好的診斷治療方法。

[1]陳善真.副豬嗜血桿菌OMP5基因的克隆表達及間接ELISA檢測方法的建立[D].華南農業大學，2010.

[2]谷禹.天津地區副豬嗜血桿菌病的流行病學調查及其防治措施的制定[D].吉林大學，2016.

[3]張巖.石河子墾區副豬嗜血桿菌病的流行病學調查研究[D].石河子大學，2013.