脂肪干細胞治療壓力性尿失禁的研究進展

陳偉康，李江，方克偉

(昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明650000)

壓力性尿失禁(SUI)指在打噴嚏、咳嗽或運動等腹壓增高的情況下，出現尿液不自主的自尿道外口滲漏的癥狀。SUI是女性尿失禁中最常見的類型，尿流動力學檢查表現為充盈性膀胱測壓時，在腹壓增加而無逼尿肌收縮的情況下出現不隨意漏尿。SUI嚴重影響患者的生活質量，妊娠、分娩損傷、年齡、肥胖等都是其發生的危險因素。根據患者病情的不同，SUI可以采取手術或非手術治療，但這些方法并不能從組織病理學上解決根本問題。隨著組織工程技術的發展，應用脂肪干細胞(ADSC)治療SUI顯示出獨特的優勢，具有良好的應用前景[1]。我們對近年來ADSC治療SUI的研究進展進行綜述。

1 ADSC的生物學特征

ADSC是一種中胚層起源、具有自我更新和分化潛能的間充質干細胞。相較于其他成體干細胞，它來源豐富、取材簡便、對機體創傷小，能夠通過細胞自身分化、增殖以及旁分泌功能起到促移植物血管化、修復組織損傷的作用，是當今治療SUI較理想的種子細胞。在體外從脂肪組織中分離ADSC通常采用酶消化法或不添加蛋白酶作用物的吸附柱法[2]，1 g 自體脂肪組織能夠獲得約5 000個ADSC[3]，遠高于其他傳統間充質干細胞的提取量。原代培養的ADSC體外細胞增殖能力強，4 h后開始貼壁，貼壁培養細胞傳代后呈梭形及多角狀成簇樣生長。與骨髓間充質干細胞相似，ADSC表達CD29、CD49、CD44、CDl05等間充質干細胞類型的分子標志物，不表達造血細胞標志物CD34、CD45[4]。此外，ADSC已被證明既缺乏主要組織相容性復合體Ⅱ(MHC-Ⅱ)，又缺乏共刺激分子CD80、CD86和CD40的表達，具有低免疫原性的生物學特征[5]。

2 ADSC治療SUI的作用機制

2.1 ADSC的多向分化潛能 ADSC作為一種成體干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能，在適宜條件誘導下可分化為脂肪細胞、肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內皮細胞和神經細胞等。現已證實，ADSC注射到尿道周圍后能夠分化為平滑肌和橫紋肌細胞[6]，應用5-氮雜胞苷誘導ADSC成肌化治療SUI也取得明確的治療效果[7]。楊平等[8]應用轉化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)體外誘導ADSC分化，發現細胞呈現明顯的血管平滑肌細胞特性，并表達血管平滑肌肌動蛋白α(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)以及Calponin等標志物。這些分化可以有效修復盆底肌肉缺陷、保持肌肉拉伸強度。ADSC也可以通過細胞之間的聯系，經隧道納米管向受損的肌細胞運輸具有正常功能的線粒體，幫助其他肌細胞恢復固有功能、減少肌細胞的損傷與凋亡，從而最大限度減輕中老年患者尿道外括約肌可能存在的退行性病變[9]。

2.2 ADSC的旁分泌作用 ADSC可以分泌成纖維細胞生長因子1(FGF1)、血管內皮生長因子(VEGF)、趨化因子2(CCL2)、基質金屬蛋白酶1(MMP1)等活化因子，起到促進內皮細胞的游走和ADSC分化、增殖的作用，且ADSC自身也可以分化成為血管內皮細胞，共同促進移植物血管生長[10]。一部分SUI患者盆底組織發生膠原含量減少，可導致韌帶、筋膜等結締組織張力降低，支持結構松弛。而ADSC可以分泌多種細胞外基質成分，包括Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和纖維黏連蛋白，能夠起到膠原填充的作用[11]，改善膠原缺失帶來的病理變化。

ADSC的旁分泌受到缺氧、細胞因子等多種因素的調節與控制。單純脂肪移植時常因為移植物不能及時與機體建立起血供聯系，導致移植組織的缺血、缺氧和最終壞死，而在添加了ADSC后卻能有效避免這種情況的發生。缺氧條件下，ADSC的線粒體會產生大量活性氧,激活ADSC細胞膜表面的受體和非受體酪氨酸激酶(TKs)，接著TK磷酸化激活PI3K-Akt-mTOR和MAPK-ERK信號轉導通路，這些信號通路的激活使缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)顯著增加。積累的HIF-1α結合到細胞核內的缺氧反應元件后，調節下游靶基因的轉錄。在這些靶基因中，特別是VEGF基因的表達明顯上調，從而起到促進移植物血管化、修復組織損傷的作用。用中和抗體或化學阻滯劑抑制Akt和ERK磷酸化，VEGF的合成會顯著減少[12]，組織血管化能力大幅減弱。外源性腫瘤壞死因子α(TNF-α)可以促進ADSC分泌IL-6和IL-8，刺激組織血管生成、免疫細胞浸潤[13]。ADSC能夠通過前列腺素E2(PGE2)的分泌抑制混合淋巴細胞的反應，使T細胞不能被活化,從而避免移植物相關的排斥反應，使用PGE2抑制劑消炎痛將會削弱ADSC的免疫抑制作用[14]。ADSC還可以釋放多種抑制炎癥的細胞因子，控制機體免疫狀態。例如IL-1a、IL-10 、IL-13的分泌就能夠阻止移植組織被機體免疫細胞破壞，并刺激組織修復、再生[15]。

總之，以ADSC為種子細胞的干細胞治療SUI，其根本機制是ADSC通過旁分泌作用分泌多種細胞因子，參與調控組織生長的微環境，促進新生血管形成，同時ADSC自身也參與細胞的增殖、分化過程，最終達到移植物血管化及組織再生的目的，這些特性使得ADSC治療SUI具有良好的應用前景。

3 ADSC在SUI治療中的應用

SUI的臨床手術治療方法包括恥骨后膀胱尿道懸吊術、經陰道無張力尿道中段懸吊術、經閉孔尿道懸吊術等。非手術方法包括生物反饋治療、盆底功能訓練等。這些治療方式雖近期治療效果好，但不能解決尿道括約肌障礙的根本問題，且相關并發癥較多。而ADSC移植作為一種新興的方法對于治療盆底疾病是一種微創而有效的手段[16]。Kuismanen等[17]對5名女性SUI患者進行ADSC聯合牛膠原蛋白凝膠和鹽水進行尿道注射治療，其方法是從皮下脂肪分離并擴增ADSC 3周，再將ADSC和膠原蛋白經膀胱鏡混合注射到尿道，1年后患者病情均顯著改善。

相比于女性，由于男性下尿路解剖結構不同，發生SUI的情況相對較少，一般見于前列腺增生術后和前列腺癌根治術后。Gotoh等[18]選擇了11例前列腺手術后出現SUI的患者，將ADSC與脂肪組織的混合物注射到尿道括約肌和尿道黏膜下，1年后8例AUI癥狀得到明顯改善，24 h漏尿量減少了59.8%，平均最大尿道閉合壓從35.57 cmH2O增加到44.7 cmH2O，功能性尿道長度從20.4 mm增加到26 mm。對于男性SUI患者，Choi等[19]研究發現，前列腺癌根治手術后出現持續SUI的患者經ADSC聯合脂肪組織治療后，患者尿失禁癥狀全部得到改善，尿流動力學指標明顯好轉，尿道壁肌層明顯增厚，患者均無炎癥、盆腔疼痛、尿急迫等不良反應。以上研究表明，尿道周圍注射自體ADSC對于男性前列腺手術后SUI是一種可行、有效的治療方法。

4 ADSC相關的新型組織工程材料研發進展

針對SUI的填充劑主要有透明質酸右旋糖樹脂復合物、膠原、碳顆粒、聚四氟乙烯等材料。這些傳統填充劑雖然制備方便，近期療效佳，但也有遠期效果不滿意、機體過敏、易產生異物肉芽腫、填充物轉移和被組織吸收等缺點[20]。近年來，應用組織工程技術構建的具有高效、持久等特點的尿道或陰道組織工程填充劑也得到大量開發。種子細胞和生物支架是組織工程的兩大關鍵性要素，支架為種子細胞提供可以黏附的表面、模擬體內細胞生存的真實環境、引導組織的依附再生。ADSC相關生物支架的開發與應用，近年來也取得了諸多進展。

4.1 ADSC與絲素蛋白微球復合體 Shi等[21]開發出一種由ADSC和絲素蛋白微球復合而成的新型組織工程填充物，注射到尿道固有括約肌障礙型尿失禁的大鼠模型后,既能對膀胱頸起到支撐作用，又能通過絲素蛋白微球上ADSC的分化和增殖，修復尿道括約肌缺陷，從而較長時間提高漏尿點壓力和尿道面積。這種具有β折疊構象的穩定態絲素蛋白經激光共聚焦顯微鏡三維立體重建和掃描電鏡觀察顯示,ADSC與生物支架黏附生長情況佳，無細胞毒性，還具備一定的生物降解能力，是治療SUI的理想組織工程材料。

4.2 聚乳酸(PLLA)/聚己內酯(PCL)生物支架 流行病學調查顯示SUI的發病率在絕經婦女中較高。這是因為絕經后卵巢功能減退，雌激素水平迅速下降，尿道黏膜萎縮，平滑肌松弛，尿道閉合力下降。雌二醇(17β-E2)能夠提高ADSC的多向分化能力，因此研究者最近研發出了可以攜帶17-βE2的支架。Feng等[22]利用PLLA和PCL制備成共混納米纖維支架，仿生細胞生存依賴的基質內環境，并將17-βE2混合培養的ADSC接種于其上，發現納米支架的生物相容性好，并且在適宜濃度的17-βE2誘導下使用PLLA/PCL支架可以顯著提高ADSC增殖能力和成肌化能力。這種新型組織工程復合物將可經皮膚吸收的17β-E2與具有一定生物力學強度的納米支架材料有機結合起來，既可以補充機體內雌激素水平,也可以對盆底局部組織起到支持、修復作用，具有極大的開發潛力。

5 展望

ADSC相關的治療措施為SUI新型治療手段的開發提供了更為廣闊的思路。從早期ADSC單獨注射，到目前與細胞因子、成纖維細胞等聯合注射，從傳統生物支架到新型生物支架的開發與應用，這些技術改進極大提高了ADSC治療SUI的臨床效果。但也有體外及動物實驗表明，ADSC可能會促進腫瘤細胞生長，增強其侵襲及轉移能力。而且，ADSC分離及體外擴增制備的所需時間較長、經濟成本高。因此，尚需進一步深入研究ADSC治療SUI的應用方法，以形成高效安全的ADSC治療方案。